一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 四 )

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▲ 同种异体CAR-T的生产（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）基因编辑应用于T细胞改造的递送方法包括慢病毒、腺病毒、AAV等病毒载体递送；使用质粒或者核糖核蛋白RNP电转；使用编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转等。然而，需要注意的是，优化这些方法的转导效率仍是基因编辑CAR-T需要改进的方向，也是降低同种异体CAR-T生产成本、扩大生产规模的重要因素。
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▲ 基因编辑技术在CAR-T改造中的应用（图片来源：Briefings in Functional Genomics） Gibco? TrueCut? Cas9蛋白（CTS?-Prototype）是一种用于临床前研究的Cas9蛋白新标准，现已上市销售，可作为工艺过程开发期间进行临床前研究和评价的早期测试材料。它专为临床前研究的严格要求而设计，并按照严格的指导原则进行生产，可确保质量和一致性，同时，其市场领先性能可与已在多家细胞治疗公司的临床项目中得到应用的Invitrogen? TrueCut? Cas9蛋白v2相媲美。
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▲ Gibco? TrueCut? Cas9蛋白（CTS?-Prototype） 2.3电穿孔电穿孔是最早和应用最广泛的非病毒转染策略之一。一个短的电脉冲作用于细胞，以产生暂时的通透性，并允许编码目的基因的DNA或RNA的注入。利用电穿孔进行mRNA转移的转导效率多在90%以上，且设计相对容易，性价比高。除此之外，利用mRNA电穿孔介导CAR基因表达，可能相比病毒转导更为安全。与通过病毒转导或质粒DNA转染引入转基因的稳定和永久表达不同， mRNA转移提供了一种胞质表达系统，可使T细胞实现CAR基因的瞬时表达。在此过程中，目前还没有证据表明mRNA会整合至人体基因组中，因此，插入诱变的可能性非常低，也不会产生具有复制能力的病毒（RCR/RCL）。Invitrogen? Neon? 电转染系统是新一代高效转染原代、干细胞和难转染细胞的电穿孔装置，具有灵活性、简易性和通用性等优势，让研究人员广泛受益。
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▲Invitrogen? Neon? 电转染系统03
细胞扩增和洗涤
通过基因修饰获得稳定的CAR-T细胞后，还需要进行大规模的体外扩增，才能获得达到治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别（根据患者体重和治疗周期决定）。扩增T细胞仍是CAR-T疗法的关键挑战之一，有许多患者最终无法接受该疗法，原因就在于这些患者的T细胞无法在体外充分扩增，未达到目标剂量。
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▲CAR-T细胞培养和洗涤（图片来源：Molecular Therapy）细胞可以通过不同的容器进行扩大，包括T瓶、平板或培养袋以及生物反应器。利用摇摆式生物反应器（例如WAVE）进行扩增，是目前主要的培养方式；除此之外，自动化的细胞生产设备（例如CliniMACSProdigy）也能够生产出大量的CAR-T ，这种自动化的设备比起摇摆式生物反应器能大大减少人为操作。