一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 三 )

本文插图
▲LV载体制备（图片来源：Methods in Molecular Biology） LV生产的上游工艺主要包括细胞培养（分为悬浮/贴壁培养等）和病毒包装；下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。与细胞分离步骤一样，载体的无菌性至关重要，因为最终的CAR-T细胞产物无法通过过滤进行灭菌。
本文插图
▲Oxford BioMedica为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程（图片来源：Molecular Therapy）目前主要存在的挑战包括LV成本高、收率低、活性容易丧失等。 LV生产成本高也是CAR-T定价持高不下的一个主要原因，因此，高成本效益的LV生产对于满足商业需求并平稳过渡到临床生产规模至关重要。Gibco? LV-MAX?慢病毒系统是首套完整的悬浮液生产系统，与使用聚乙烯亚胺（PEI）的慢病毒生产方法相比，该系统产量可提高十倍之多，成本降低一半以上。 Gibco? LV-MAX?慢病毒生产系统能够达到>1 x 10^8 TU/mL（未浓缩）的高滴度，提供研究级及Gibco? CTS? LV-MAX?慢病毒生产系选择，后者既符合GMP医疗器械标准（21CFR第820部分），同时遵守美国药典USP <1043>**和欧洲药典Ph. Eur. 5.2.12建议。
本文插图
▲ Gibco? CTS? LV-MAX? 慢病毒生产系统 2.2 基因编辑目前已上市的 CAR-T细胞和大部分在研细胞免疫疗法仍然属于自体疗法。然而，自体疗法存在着成本高、等待时间长、T细胞质量参差不齐、治疗实体瘤效果不明显等局限性，这也使得同种异体（也称为“现货型”、“通用型”）CAR-T的开发显得尤为必要。基因编辑技术可以实现外源基因的靶向插入或内源基因的定向敲除，精确构建CAR-T细胞，已在同种异体CAR-T疗法的开发中被广泛使用。基因编辑应用于同种异体CAR-T ，可以限制移植物抗宿主病（GVHD）和免疫排斥反应的发生，同时也能够实现CAR-T细胞功能的增强。
本文插图
▲ 利用CRISPR/Cas9构建同种异体CAR-T（图片来源：Human Vaccines & Immunotherapeutics） CRISPR/Cas9是现在应用最广泛，研究最深入的基因编辑工具。与TALENs和ZFNs相比， CRISRP/Cas9的精确性更高，能降低脱靶效应带来的副作用，且更利于规模化生产。从生产过程来看，同种异体CAR-T与自体CAR-T大体上类似，不同点在于同种异体CAR-T的原材料来自健康供者而非患者；另外，采用基因编辑的同种异体CAR-T生产过程中，增加了引入基因编辑工具改造特定基因的一步。