专家论坛｜尹明：HBV感染的动物模型研究进展( 四 )

通过小鼠的脾脏异种移植人原代肝细胞(PHH) ，可以整合到免疫缺陷的肝损伤小鼠的肝实质中。这样获得的人鼠嵌合肝脏小鼠可以更好的模拟HBV自然感染和cccDNA复制过程。目前，文献报道或商品化的主要有5种人源化肝脏小鼠模型(表 2) 。

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尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在细胞外基质的降解过程中发挥重要作用。 uPA系统包括uPA、uPA受体和它的2种抑制剂——纤维蛋白溶酶原激活质抑制物PAI-1和PAI-2 。纤溶酶通过直接或间接激活基质金属蛋白酶(MMP)来降解细胞外基质和层黏连蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白聚糖、Ⅳ型胶原等基膜成分。 uPA参与多种生理和病理过程，在肝脏再生过程中uPA通过激活纤溶酶清除坏死的细胞，并且能够降解胞外基质促进肝小叶结构的重建。早在1991年Sandgren等[43]就做出了Alb-uPA转基因小鼠，由于uPA的肝毒性， Alb-uPA小鼠在出生4天就会出现出血症状。 2000年Weglarz等[44]作了改进，制作了MUP-uPA转基因小鼠，使用MUP增强子/启动子在肝细胞中特异性表达uPA ，用来研究肝细胞移植。与Alb-uPA类似，由于基因丢失， uPA的表达会逐渐降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2~4周之后才会开始表达uPA ，从而降低新生小鼠的病死率。 MUP-uPA小鼠的人源化肝脏重建水平比较低。 2004年， Tateno等[45]报道了uPA-SCID小鼠，可以高水平人源化重建小鼠肝脏。 uPA-SCID小鼠需要在出生后2周内重建肝脏，繁殖比较困难，属于不能调控的肝损伤模型。 5.2 FRG小鼠2007年， Azuma等[46]报道了FRG小鼠，即将延胡索乙酰乙酸水解酶基因(Fah)敲除小鼠回交到Rag2-/- &Il2rg-/-敲除的高度免疫缺陷背景，可以实现高水平的人源化重建。小鼠Fah基因敲除后，酪氨酸在体内代谢障碍，造成延胡索乙酰乙酸(FAA)积累，从而引起肝细胞的损伤。 NTBC是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的抑制剂，可以阻止FAA的积累，服用NTBC可以有效地改善酪氨酸血症的症状。 FRG小鼠繁育时喂饲低酪氨酸日粮或者饮水补充NTBC 。若需要肝损伤重建时，可以逐步撤去NTBC ，属于可调控肝损伤模型。 5.3 TK-NOG小鼠TK-NOG小鼠是另一种诱导性肝损伤模型，由白蛋白启动子驱动单纯疱疹病毒肝特异性表达病毒1型胸苷激酶(HSVtk) ，然后回交到NOD/Shi scid小鼠背景[47] 。因为阳性雄鼠不育，这个模型扩繁困难。 5.4 AFC8小鼠2011年， Washburn等[48]报道了一种在Alb启动子之后表达融合蛋白FK506结合蛋白(FKBP)和caspase8的转基因小鼠(AFC8) ，该小鼠模型受到AP20187(一种二聚体FKBP)选择性调控，然后通过回交的方式获得了Balb/C Rag2-/-&Il2rg-/-背景的AFC8小鼠。这个模型的人源化肝重建水平比较低(约30%) 。 5.5 URG?小鼠该模型是国内最早的人源化肝脏小鼠模型。 URG小鼠由4种基因修饰动物模型交配获得，包含2个转基因和2个基因敲除。其核心模型源于2009年Song等[49]构建了TRE-uPA转基因小鼠和Alb-rtTA转基因小鼠，然后交配获得了Alb-rtTA/TRE-uPA双阳性小鼠；通过Dox诱导，在该小鼠中检测到uPA表达和肝损伤。北京维通达生物技术有限公司的研发人员将Alb-rtTA/TRE-uPA双阳性小鼠连续8代回交到NRG(NOD背景Rag2null/ Il2rgnull小鼠)背景， 2012年获得Alb-rtTA/ TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠。作为新一代的可调控肝损伤人源化肝脏小鼠模型，人源肝脏细胞可以实现高达95%整肝重建，满足HBV药物的药效、药代和药动等相关实验需要。使用该模型，也发表了一系列高水平研究论文[50-53] 。宿主免疫应答在HBV感染中起着至关重要的作用，然而上面5种人鼠嵌合肝脏小鼠，均为高度免疫缺陷背景，无法直接用于HBV特定的免疫和炎性反应研究。 Washburn等[48]开发了一种人源化小鼠模型(AFC8-hu-HSC/Hep小鼠) ，共移植人CD34+造血干细胞(HSC)与肝细胞祖细胞进入新生(出生后第1周内)的转基因小鼠，同时具有人类免疫系统和人的肝细胞。但是这个模型人肝细胞重建水平低，也未检测到抗原特异性B淋巴细胞和T淋巴细胞反应。 2014年，这个小组建立了A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep双人源化小鼠模型(人HLA-A2转基因的NSG小鼠) ，人HLA-A2转基因促进人MHC限制性T淋巴细胞的发育；小鼠特异性抗Fas激动剂治疗抗体(JO2)支持人体免疫细胞和肝细胞的再增殖[54] 。 A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep小鼠可支持持续性HBV感染(＞4个月)与HBV特异性人类免疫有关的肝纤维化；而且在HBV感染的嵌合肝脏中，观察到活化的人M2样巨噬细胞聚集，这与HBV引起的急性和慢性感染相似。但是，该模型移植的细胞来源于流产胎儿组织，存在伦理问题的限制。 2015年, Strick-Marchand等[55]报道，使用BRGS-uPA小鼠(BALB/c Rag2-/- &Il2rg-/- NOD.sirpa uPAtg/wt) 实现了更高水平的双人源化重建。在BRGS-uPA小鼠出生后(＜1周龄)辐照并移植CD34+造血干细胞重建人源性免疫系统；在4~8周时移植成年人肝细胞重建肝脏。嵌合肝脏重建水平可以达到20%~50% ，且在嵌合肝脏中检测到了多种免疫细胞亚群，可以检测到幼稚的T淋巴细胞(CD45RA+)和成熟的B淋巴细胞，以及人源的Igs抗体。尽管人类HSC和人肝细胞的HLA不匹配，但未观察到任何移植物排斥反应。由于肝细胞移植是在HSC注射后4~8周内进行，即在成熟T淋巴细胞出现在外周器官之前，研究人员推测肝细胞产生的同种异体抗原，呈现给发育中的胸腺细胞，使其具有耐受性；另一个解释是肝脏微环境的耐受性，肝内抗原呈递细胞可以将免疫应答向免疫调节表型倾斜，从而保护肝细胞免受免疫攻击。在HBV肝细胞感染期间，免疫反应在介导病毒根除或持续存在中起着重要作用。这种新型的双人源化模型可能是研究单感染和共感染免疫反应的一个合适的平台，可以应用于测试新的治疗策略或候选疫苗。 2019年Yuan等[56]使用FRGS小鼠(Fah-/-Rag2-/-IL-2R-/-SCID)移植了人类骨髓间充质干细胞(hBMSCs) ，可以转分化为双人源化小鼠模型(hBMSC-FRGS) ，但重建水平比较低。尽管肝脏和免疫双人源化小鼠模型理论上是完美的模型，目前仍受到生产困难、高成本和一系列伦理等因素限制。 6小结