专家论坛｜尹明：HBV感染的动物模型研究进展( 三 )

2001年， Sprinzl等[29]开发了腺病毒载体携带1.3倍的鸭HBV基因组(Ad-DHBV) ，经尾静脉注射进入小鼠体内的方法。采用类似的方法， von Freyend等[30]将含有1.3倍HBV基因组的腺病毒载体(Ad-HBV)注射到C57BL/6小鼠体内，在小鼠肝脏中检测到3个月以上的HBV转录产物。由于腺病毒载体很大，同时编码一些非HBV病毒产物，这些产物也可能诱导免疫反应来清除HBV[31] 。肝细胞靶向AAV载体具有低免疫原性的特点，将AAV-HBV通过小鼠尾静脉注射，成功建立了AAV-HBV小鼠模型[32-33] 。这类模型可以持续产生HBV病毒颗粒和HBV抗原且1年以上无血清转化，重现了临床CHB患者的部分免疫学特征。因而， AAV-HBV模型也被用于评估新的基于免疫的疗法和抗病毒治疗[34] 。目前常用的rAAV8-1.3HBV病毒载体，经尾静脉注射到野生C57BL/6小鼠体内，其表达水平随重组病毒注射剂量的增加而升高，高剂量注射时可造成超过40%的肝细胞感染HBV ，血清中HBV DNA可达105 IU/ml 。但要注意不同小鼠品系HBV感染的表型存在差别。 2017年Lucifora等[35]报道通过Southern印迹分析可检测到AAV-HBV中存在cccDNA ，然而这些cccDNA ，是不是通过小鼠肝细胞中的rcDNA前体产生的仍不清楚，目前也无新的研究报道。另外在这些模型中， HBV的复制不是由cccDNA直接驱动的，而且重组AAV基因组进入体内后，一部分可以形成大的多聚体并整合到宿主基因组中，从而使得这些模型与cccDNA的相关性降低[36] 。尽管如此， AAV-HBV模型仍是用于评估免疫疗法和抗病毒治疗的主要模型。 4cccDNA替代小鼠模型
HBV感染的人肝脏细胞中含有3.2 kb松弛环状rcDNA ，在细胞核中， rcDNA修复为cccDNA是病毒转录复制的起始模板。 cccDNA转录的病毒前基因组RNA(pregenomic RNA ， pgRNA)在细胞质内包装入核衣壳，通过反转录起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣壳颗粒再次转运至细胞核，完成细胞内的病毒复制周期。 HBV基因组高度压缩，难以容纳外源性序列[37] 。已经开发了多种途径，通过体外重组生产cccDNA(rcccDNA)[38] ， rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生，是HBV研究的一类重要工具。 2014年Qi等[39]开发了一种基于HDI的重组cccDNA小鼠模型，通过Cre/loxP介导的DNA重组在体内生成cccDNA 。在HBV基因组两侧引入同向LoxP位点，由重组酶Cre引发LoxP位点之间的DNA重组和环化，生成含有单拷贝LoxP位点的rcccDNA；LoxP位点则位于一段约90 bp的外源性内含子中(HBsAg基因近5′端) ，可在RNA转录过程中移除，实现所谓的无缝插入。然而，该模型中病毒复制水平较低，体内持续时间较短，可能是由于转染细胞中Cre依赖性重组酶激活了免疫系统。另外两个含DNA的细菌质粒共转染，重组效率低，导致cccDNA转染肝细胞非常低。传统的含有DNA的细菌质粒，导致体内转基因的快速转录沉默，即使载体DNA仍然保留在细胞中。 Kay等[40]开发了一种PhiC31整合酶介导的分子内重组技术，以制备无细菌主链的微型环载体DNA ，可在体外和体内表达高水平的转基因。基于大肠杆菌PhiC31重组酶诱导表达系统，建立了一种体外诱导rcccDNA attR微环产生和纯化的策略，纯化的rcccDNA attR微环具超螺旋结构，能够支持功能性的HBV复制和抗原表达。由于rcccDNA编码中包含外源内含子序列，应用引物特异性PCR方法易于与HBV DNA复制中间体及从头合成的新生cccDNA区分。最近，在采用复制缺陷腺病毒载体将rcccDNA转入肝脏特异的Cre小鼠中检测到HBV的时间超过62周[41] 。在小鼠肝脏中，观察到了持续坏死性炎症反应、纤维化和肝硬化等病理学特征，与临床慢性肝炎相似。 Yan等[42]发表的文章中，将39 bp的attR位点设计插入在HBV多聚酶基因的spacer区(PreS1起始密码子前) ，显示并不影响病毒复制。通过免疫正常的小鼠尾静脉HDI注射rcccDNA ，可短期诱导HBV抗原血症(平均5~7周) ，与急性HBV感染相似。他们比较了C3H/HeN、FVB/N和CBA/J三种小鼠，其中C3H/HeN小鼠感染率最高，半数以上小鼠体内HBV复制持续1年以上。 cccDNA替代模型可用于研究慢性病的免疫反应和发病机制，这也有助于评估cccDNA靶向抗病毒药物策略。然而，由于这类模型仍是小鼠的肝脏细胞，不涉及HBV的入侵、扩散和再传染的过程，仍不能替代人鼠嵌合肝脏人源化小鼠模型。 5人鼠嵌合肝脏小鼠模型