专家论坛｜尹明：HBV感染的动物模型研究进展( 二 )

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1HBV转基因小鼠模型
在HBV启动子或者小鼠肝细胞特异启动子(如白蛋白启动子Alb)的控制下，将编码HBV蛋白的基因序列通过原核注射转入到小鼠中，获得表达HBV蛋白的转基因小鼠，如病毒包膜(envelope ， S基因)[10-12]、核心(core ， C基因)[13]、前核心(precore ， preC基因)[14]和X基因[15-16] 。这些模型对HBV的特性验证提供了重要的数据支持。随后，有两个研究小组[17-18]用全长或者超长的HBV全基因序列制成转基因小鼠，然而仅在少数转基因小鼠的器官中检测到病毒复制和蛋白表达，其血清中病毒的滴度很低。在乙型肝炎抗病毒药物筛选方面应用较多的转基因小鼠模型是Guidotti等[19]研发的，其在HBV全长序列5′末端重复一个C基因和X基因及其增强子，构建了1.3倍全长HBV基因组的转基因小鼠。该小鼠血清中可检测到HBsAg、HBeAg和HBcAg ，在小鼠体内也检测到完整病毒颗粒的形成，且病毒颗粒具有感染性。该转基因小鼠肝脏和肾脏中有高水平的HBV表达，外周血清中的HBV DNA拷贝数高达107 IU/ml ，其HBV抗原转录水平与CHB患者相当，已经成功用于HBV合成、转录，病毒组装和成熟的病毒分泌等抑制药物的药效实验[20-22] 。然而，由于转基因模型中HBV整合在小鼠基因组上，是组成型表达(在胚胎期即表达) ，因而对HBV有天然的免疫耐受性，不适宜于进行免疫病理学方面的研究。另外， HBV转基因小鼠中包含了rcDNA(relaxed circular DNA)合成、转录，病毒组装及成熟的病毒分泌，但未检测到cccDNA形成，尚不清楚不能形成cccDNA的原因[23] 。为了解决HBV抗原免疫耐受的问题，王军等[1]综述了不同的方案，比如用HBV转基因小鼠与免疫缺陷小鼠(如SCID、TCRα-/- ，和RAG1-/-等)杂交，构建了免疫缺陷背景的HBV转基因小鼠。这些小鼠缺失T和B淋巴细胞，给该小鼠过继输入相同遗传背景的野生型小鼠脾脏细胞(T和B淋巴细胞) ，使表达HBV的小鼠肝脏细胞暴露在重建的免疫系统中，得到了类似于人类的HBV感染模型，但其操作过程比较复杂，且与人类感染HBV后引起肝脏炎症的自然病程相比仍有较大差别，表明鼠肝脏中存在与人肝脏细胞不同的特征，如存在不易感HBV的微环境或者结构等。另一种解决HBV抗原免疫耐受问题的方法是通过基因表达调控系统，如Tet-on系统，在特定的时间及部位(肝脏)诱导HBV基因表达，但该类模型同样存在肝炎特征与人类肝炎差别较大的问题。 2HDI小鼠模型
利用瞬态水动力机械地(高压)将HBV DNA挤入肝细胞，可以导致短暂的HBV复制以及蛋白质合成。 2002年， Yang等[24]首次建立了HBV水动力注射小鼠模型。在小鼠尾部静脉，通过注入大量生理盐水，相当于小鼠体质量的8%~10% ，其中含有1.3倍HBV基因组DNA的质粒，在很短的时间内(5~8 s)注射到小鼠静脉内。但是随着小鼠体内HBV特异性抗体和细胞毒性T淋巴细胞的出现，血液中的HBV抗原通常在第7天消失；而肝脏HBV转录物在转染后第15天被清除，与抗病毒抗体和抗病毒CD8+T淋巴细胞的出现相吻合。在NOD/SCID小鼠中缺乏功能性T和B淋巴细胞、HBV基因表达和复制可以持续超过81天，表明宿主的免疫反应，特别是病毒特异性CTL反应可能在抗HBV中起重要作用。 HDI小鼠模型是一种方便、可行的方法，直接用于不同基因型、变异或突变的HBV模型构建。而且HBV基因组没有整合到宿主基因组中，为研究HBV免疫反应和发病机制提供了可能。然而，水动力注射程序导致严重的肝损伤，使实验结果的解释复杂化，尤其是在免疫反应和发病原因方面造成混淆[25] 。另外，低的转染效率(5%~10%)和持续时间短也限制了该模型的使用[26-27] 。另外，小鼠的遗传背景、年龄、性别和免疫系统状态等也会影响HDI小鼠模型中HBV在体内的持久性[24, 28]3AAV-HBV转染小鼠模型