科研 | mSphere：多菌种肠道微生物群落中病原菌与共生菌个体间相互作用的研究( 五 )

图7 生物膜内多雷菌与艰难梭菌的相互作用。显示了生长24小时的多雷双歧杆菌和艰难梭菌的单一或混合生物膜培养物的CFU计数。所示数据为三次独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。显著性差异采用非配对t检验。 ***, P < 0.001 。讨论
研究肠道微生物群成员之间的分子相互作用对于了解肠道内稳态和定植抗性等重要现象非常重要。作者首次建立了一个复杂的混合生物膜群落，由九个具有代表性的肠道共生物种组成。在这里报告了一个基于PCR的方法来调查这个复杂群体中的个体相互作用。定量测定了不同时期细菌数量的变化，并研究了肠道病原体艰难梭菌对该群落的影响。结果证明了几种艰难梭菌在数量上的变化，包括类杆菌属。进一步证明了类杆菌属中的一种， B.dorei ，可以减少艰难梭菌在双种生物膜中的生长。目前，用于追踪肠道内物种间相互作用的主要技术是基因组学和宏基因组学。基因组测序提供了很好的洞察什么是目前，但没有提供短期动态和潜在的细菌相互作用的信息。作者选择使用还原论的方法，将少量具有代表性的肠道物种进行共培养，以便更容易获得输出数据，提高可以测量单个物种变化的分辨率。事实上，作者还没有涵盖所有的关键物种，但鉴于作者选择的量化技术，现在有可能扩大这一种群，以包括更多的物种。测序的主要缺点是它的费用，因此，它通常用于分析包含数百个物种的复杂样品。与标准qPCR一样，基因组测序并不能消除“死亡”DNA的定量，而“死亡”DNA是准确定量活细菌数量的关键。另一种替代PMA-qPCR的方法是荧光原位杂交（FISH）。 FISH的几种变体已被用于定量群落内的细菌；然而，基于qPCR的定量通常被认为比FISH方法更敏感、更快速、更省力。事实上， FISH作为一种补充分析，将增加群落的关键空间细节。因此， PMA-qPCR方法是一种简单可靠的方法来量化复杂群落中个体成员的变化。作者能够在72小时内成功地追踪九种混合生物膜中的所有物种。有趣的是，在实验过程中，没有一种物种占优势；这表明物种之间更可能发生交叉取食，而不是直接竞争。作者认为，到72小时，这种生物膜作为一个整体并不稳定，所有物种的细菌数量都有所下降。即使是在最初48小时内表现出积极生长迹象的物种（如卵形双歧杆菌和青春期双歧杆菌[图2]）也是如此，这种下降可能是由于废培养基变得有毒和/或生长受限。实际上，静态生物膜培养模式的一个缺点是缺乏持续的营养供应和有毒副产物的去除。然而，这样的生物膜模型更容易建立，并在较短的时间内提供有用的信息。在流动细胞内发展这种多细菌生物膜，使营养物质在厌氧条件下持续流动，将使监测反应的时间更长。在一个共生群落中加入一种病原体，可望引起对它的反应。为了调查这一点，研究反应肠道病原体艰难梭菌介绍。艰难梭菌是一种机会性肠道病原体，引起艰难梭菌感染（CDI），是美国医院相关性腹泻的主要原因，每年新增50万例，重复感染率为1/5 。对艰难梭菌定植的最好防御是健康的肠道微生物群，它提供对疾病的自然免疫。抗生素与它们所针对的病原体一起对肠道微生物群产生负面影响，导致肠道微生物群的改变和CDI的可能性增加。肠道微生物群的明显变化与CDI有关；然而，由于大多数数据来自粪便样本的测序，因此缺乏关于粘膜相关种群和定植早期变化的信息。有趣的是，艰难梭菌的存在导致了共生群落中许多微生物物种的粘附增加（图3A）。作者预测艰难梭菌可能产生一种代谢副产物，改善微生物群中物种的初始生长和结合，或者艰难梭菌产生的信号分子被微生物群检测到并诱导这些物种内的代谢变化。有必要使用艰难梭菌进行进一步研究，以确定可溶性因子是否参与观察到的粘附增加，或者这是否是一种代谢效应。当艰难梭菌与微生物群（图3B）一起培养时观察到的初始粘附的减少是预期的，因为有大量关于微生物群对艰难梭菌定植的破坏作用的数据。粘附性的小幅度降低（约50%）可能是因为微生物群落没有预先建立，这通常是感染艰难梭菌的情况。胆汁酸和胆汁盐对艰难梭菌在肠道的定植能力有相当大的影响，微生物群会转化艰难梭菌萌发所需的主要胆汁酸，如牛磺胆酸。它们转化成的次级胆汁酸也能抑制艰难梭菌的生长。作者使用的培养基中没有胆汁酸，这表明观察到的艰难梭菌抑制不是通过初级胆汁酸转化为次级胆汁酸。因此，通过次级胆汁酸的产生来阻止细菌萌发似乎只是定植抗性机制的一部分。事实上，当在引入艰难梭菌前24小时预先建立微生物生物膜时，作者发现艰难梭菌的生长受到很大影响（图5A和B）。预先建立微生物群可导致共生细菌的丰度增加，并导致任何分泌的抑制分子水平升高。此外，艰难梭菌粘附所需的物理空间将少得多，艰难梭菌所需的任何营养物质都可以在这一阶段从培养基中取出。在一次成功的感染中，艰难梭菌已经被报道通过调节细菌代谢，包括吲哚的产生来控制微生物群。它通过影响色氨酸酶（tnaA）在其他物种中的表达来实现这一点；艰难梭菌被认为通过吲哚介导的抑制肠道保护细菌的生长来限制微生物群的恢复。当艰难梭菌与共生群落共培养时，观察到多雷双歧杆菌、卵形双歧杆菌、大肠杆菌、普氏镰刀菌的数量有小而显著的增加。虽然这9个物种中，卵形芽胞杆菌、θ型芽胞杆菌、青春期芽胞杆菌、大肠杆菌和普氏芽胞杆菌是吲哚产生菌，但没有发现抑制作用。鉴于艰难梭菌反而受到抑制，有可能细菌无法达到足够的数量来影响吲哚的产生。此外，在预先建立的群落中加入艰难梭菌后，发现与对照组相比，大肠杆菌数量增加（图6）。同样，在CDI患者中经常发现过多的变形杆菌，这是艰难梭菌成功感染的一个特征。然而，平行观察到的多种拟杆菌数量的增加可能解释了在这个系统中观察到的艰难梭菌的抑制作用。艰难梭菌感染与类杆菌的显著减少有关，这可能提示肠道内这些细菌具有保护作用。有趣的是，艰难梭菌与多雷类杆菌（一种丰富的肠道共生物种）共培养时，其生长受到负面影响（图7）。在脆弱类杆菌存在的情况下，艰难梭菌的生长量减少。值得注意的是，脆弱双歧杆菌与多雷双歧杆菌非常相似，与艰难梭菌混合培养的数量比单独培养的数量多，并且生长抑制作用对生物膜生长具有特异性，这表明细胞间的相互作用/物理接近可能起到了一定的作用。作者最近也报道了在体外肠道模型中艰难梭菌在上皮细胞上的生长在多雷双歧杆菌的存在下减少。最近有报道称，脆弱双歧杆菌通过潜在影响上皮屏障的完整性，在小鼠感染模型中预防艰难梭菌感染。虽然这些数据支持类杆菌在预防艰难梭菌感染方面的作用，但感染艰难梭菌的患者通常会减少类杆菌的丰度和多样性。作者的数据可能表明，如果没有先前的微生物群干扰，例如使用抗生素治疗，艰难梭菌不能减少拟杆菌的数量，而是通过改善生长来加强拟杆菌的优势。结论