【医世象】结直肠癌与微卫星不稳定的10个临床问题

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微卫星不稳定（MSI）是指由于错配修复（MMR）蛋白缺失（dMMR）导致微卫星序列（通常由1~6个核苷酸为单位的串联重复DNA序列）复制错误不能被修复，当错误累积到一定程度即形成微卫星高度不稳定（MSI-H）。
目前在结直肠癌（CRC）诊疗中已常规开展微卫星稳定性检测，但其对CRC的临床指导意义部分尚存在争议。以下我们将提出并回答10个CRC与MSI的临床问题，以期能引发一些思考并提供临床参考建议。

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01 哪些结直肠癌需要进行MSI/MMR检测?
目前越来越多的证据显示，无论家族史和发病年龄，对CRC患者进行林奇综合症（LS）的筛查有助于发现更多的LS患者，而MSI/MMR检测是筛查的重要手段；对于Ⅱ期CRC预后、高危Ⅱ期辅助治疗的选择，以及Ⅳ期CRC免疫治疗均有明确的指导作用。
虽然微卫星状态对Ⅲ期CRC的价值尚存在争议，但氟尿嘧啶单药辅助化疗不获益的结论对不能耐受含铂方案的患者仍有重要提示价值。因此，美国NCCN指南及美国胃肠病协会均建议对所有CRC无论年龄及分期，都应该进行MSI/MMR检测。
02 如何选择MSI/MMR的检测方法？
目前检测微卫星状态的方法主要有三种，包括免疫组化（IHC）、聚合酶链式反应（PCR）以及二代测序（NGS）。
2.1 聚合酶链式反应（PCR）
采用PCR方法比较肿瘤组织和正常组织DNA中重复核苷酸序列长度是最早确立检测CRC微卫星状态的分子手段，也是MSI检测的金标准。目前最常用的Bethesda标准由2个单核苷酸重复序列（BAT-25和BAT-26）和3种二核苷酸重复序列（D5S346 ， D2S123和D17S250）构成。
就Bethesda标准而言，五个位点中出现2个或以上的不稳定（Pentaplex panel出现3个及以上或更大panel中存在≥30%的重复不稳定序列）为MSI-H ，存在1个位点（或更大panel中10%~30%的重复不稳定序列）为微卫星低度不稳定（MSI-L），而无不稳定位点（或更大panel中＜10%重复序列）则为微卫星稳定（MSS）。
既往研究表明MSI-L与MSS肿瘤生物学特点没有明显的差异，所以临床中通常将MSI-L与MSS归为一组微卫星稳定。虽然PCR是“金标准” ，但由于不能提供准确的突变基因、实验周期较长等特点一定程度上限制了其临床的使用。
2.2 免疫组化（IHC）
免疫组化以其简便快捷的优势成为目前最常用的检测方式，通过使用相应抗体检测四种常见错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）在细胞核内表达的情况，明确是否存在错配修复功能缺陷。存在1种或以上蛋白表达阴性即为dMMR ，相当于MSI-H；否则为错配修复蛋白完整（pMMR），相当于MSI-L/MSS 。
IHC检测的MMR经过严格质控后可以达到与PCR检测90%~95%以上的一致率。另约有5%~11%的MSI-H CRC四个错配修复蛋白可以完整表达，其原因包括错配修复基因一些少见的错义突变（多为MLH1和MSH6基因）虽然影响其蛋白功能，而蛋白翻译和抗原性正常，仍能被抗体所识别， IHC检测实为“假阳性”；此外，由于错配修复系统的蛋白存在功能重叠（PMS2和PMS1、MSH6和MSH3），因此虽然蛋白表达缺失， IHC表现为dMMR ，而PCR却显示MSS 。免疫组化检测本身也存在主观性，且受检测抗体质量、检测过程（固定、染色）等因素影响，导致各中心的检测准确率高低不一。
2.3 二代测序（NGS）
随着高通量测序技术在肿瘤领域的深入发展， NGS也开始应用于MSI检测。对于CRC而言，同时进行MSI和RAS、RAF等靶向基因检测可以减少组织样本需求量。此外，检测肿瘤突变负荷（TMB）、胚系基因，并发现PCR不能测出的体细胞杂合性缺失突变以及其他基因结构突变导致dMMR ，也是NGS的优势。