使用非病毒方法生产 CAR-T 细胞( 五 )

3. CAR T细胞制造
前面提到的所有 CAR T 细胞制备方法都有其优点，但某种方法的最终成功取决于其在严格监管的 cGMP条件下的重现性。这些条件决定了当前细胞疗法生产的复杂规则集。 CAR T 细胞制备的每个方面都需要详细记录并符合 cGMP 指南，从洁净室设施的规范开始，到制造将发生的地方，到强调无菌实验室技术、培养基的含量和直接参与产品培养和最终产品加工（冷冻保存、质量控制测试等）的其他化学品（在 [75] 中进行了审查）。
3.1. CAR T细胞培养
单独的培养过程被认为是基于 CAR T 细胞疗法开发的关键部分。为了避免培养过程中的污染，封闭或半封闭培养系统和生物反应器被认为优于在培养瓶中的简单培养。
G-Rex（Wilson Wolf Manufacturing）代表了一个广泛使用的半封闭细胞生产系统的例子，该系统利用在带有透气膜的烧瓶中进行培养，从而实现更好的气体交换并显着增强细胞增殖。虽然该系统在使用普通培养瓶的基础上进行了升级，但它不是全封闭的，潜在的污染风险可能高于全封闭系统。
完全封闭的系统（例如 CliniMACS Prodigy 或 Quantum 细胞扩增系统）能够在单个管道组内执行整个过程（从细胞转导到扩增）。 CliniMACS Prodigy 管组主要专注于通过慢病毒载体转导和随后通过抗CD3/CD28 抗体激活来制备 CD19 CAR [76] 。与其他已建立和常规培养技术的产品相比，最终的 CAR T 细胞产品表现出相似的特性 [77] 。Quantum细胞扩增系统普遍用于制造贴壁细胞，如间充质干细胞 (MSC) [78] ，但也证明了 CAR T 细胞的扩增是可能的 [79] 。
尽管完全封闭的系统最大限度地减少了污染的可能性，但基于病毒的载体的局限性及其总体高成本大大降低了它们在临床实践中的潜在应用。目前对单个患者的 CAR T 细胞治疗成本的估计范围为 150 000 至 300 000 美元 [63, 80] 。
通过质粒/转座子制造 cGMP 质量的 CAR 通常仅限于在开放或半开放培养系统中培养，因为电穿孔（或脂质转染）过程在封闭培养系统中尚未自动化。通过电穿孔转导的 CAR T 细胞可以在 cGMP 条件下成功制备 [81] ，尽管对人员的无菌技术要求明显更高。
为了提高 T 细胞的转导后扩增和效率，将各种细胞因子添加到培养基中。最常用的促进 T 细胞扩增的细胞因子可能是 IL-2 [82] 。尽管越来越多的研究表明更高浓度的 IL-2 可以驱动 T 细胞的 CD8+ 部分进入终末分化，但这种更高的 IL-2 浓度不会促进记忆 T 细胞的形成 [83, 84] 。因此寻求不同的白介素组合来改善 T 细胞培养的特性。为了防止 T 细胞发生终末分化，经常使用 IL-7、IL-15 和 IL-21 的组合[85] 。 IL-21 在促进 CD8+ 细胞毒性方面与 IL-2 相似，但方式相反。添加 IL-21 可抑制 CD8+ 的终末分化，可被视为一种 IL-2 拮抗剂 [86] 。 IL-7 和 IL-15 促进培养的 T 细胞内记忆表型的形成 [87] 。同时，在 IL-7 和 IL-15 组合存在下的T 细胞增殖比在 IL-2 存在下的 T 细胞增殖导致更有效的抗肿瘤 CAR [88] 。