使用非病毒方法生产 CAR-T 细胞( 三 )

SB 转座子的整合概况接近于随机。 SB 系统针对 TA 站点进行集成 [29] 。与病毒载体 ([30]) 相比， SB 转座子反复证明对编码序列没有整合偏向 [31, 32] 。尽管可以认为 SB 整合谱在生物学上是安全的，但其他转座子载体表现出的特性更类似于基于病毒的载体 [32] 。
转座子 Tol2 是适用于创建 CAR T 细胞的成功转座子系统的另一个例子 [33] 。与 na?ve SB 转座子相比， Tol2 提供了更大的编码能力 (100-200 kb) 和足够的转座活性 [34] 。 SB 转座子更喜欢 T-A 碱基进行整合，而 Tol2 似乎具有随机整合偏好 [33] 。
SB 转座子的最大竞争很可能是 PiggyBac (PB) 转座子系统。与前面提到的转座子类似， PB 转座子使用简单的剪切和粘贴机制将自身整合到人体细胞中。整合位点是非随机的，因为 PB 转座子通常更喜欢 TTAA 序列[36] 。 PB 整合图谱的映射揭示了与γ-逆转录病毒和慢病毒载体的相似性 [37] ，具有与 MLV 逆转录病毒相当的表达基因的插入偏向性 [38] 。
与其他（Tol2 和 SB11）转座子系统相比， PB 转座子系统在哺乳动物细胞中表现出优异的转座活性 [39] 。在各种哺乳动物细胞中更高的转座活性使 PB 转座子位于潜在的非病毒载体的顶部，用于人类细胞转基因和 CAR T 细胞的制造。
质粒的另一个基本能力是“货物”容量的大小。癌细胞有多种机制来避免免疫反应，而最佳的 CAR 结构需要克服这些机制中的大部分才能使治疗成功。 PB 转座子系统被证明能够将多个基因转移到 T 细胞中，从而使它们更有效地用于癌症治疗[40] 。 Nakazawa 的 [40] 研究还证明了 PB 系统能够以自杀基因的形式携带和转移安全开关到人类 T 细胞中。在严重细胞因子释放综合征 (CRS) 的情况下关闭患者体内 CAR T 细胞的能力可能是该技术最重要的安全特性 [41] 。成功分离了 PB 转座子的许多高活性突变变体 [42] 。 7PB 变体在转座活性方面能够胜过原始 PB 转座子和 SB100X 转座子[43] 。改进的 PB 系统的另一个例子是“小鼠密码子优化的 PB 转座酶基因”——mPB [44] 。
PB 系统已成功用于生成用于血液系统恶性肿瘤的 CD19 CAR [45] 以及针对选定实体肿瘤抗原的 CAR ，例如 CD73 [46]、MSLN[47]、EGFRvIII [48] 和 PSMA [49] 。病毒载体与两种最常见的转座子载体的比较见表1 。

本文插图

转座子衍生的质粒载体依赖于将它们递送到细胞中的系统。最近，最常用的方法是细胞电穿孔，其主要优点是程序相对简单，并且该方法的总体成本较低。质粒 DNA 的电穿孔目前正被信使 RNA (mRNA) 的电穿孔所超越。质粒 DNA 进入细胞核的主要障碍是核被膜。因此，分裂细胞表现出比非分裂细胞高得多的转导率[50] 。随着 mRNA 转移，克服核膜的需要变得多余，尽管出现了其他问题（主要是与质粒 DNA 相比， mRNA 分子的稳定性降低）。 RNA 核苷的化学修饰（例如，掺入假尿苷 [51]）显着降低了 mRNA 稳定性的不足问题。