由单细胞层面探究鼻咽癌的肿瘤异质性和细胞间的互作网络( 三 )

接下来作者运用了与CD8+T 分析类似的方法，首先将11,631个细胞分在了4个细胞簇中，分别为Treg_C1_SELL、Treg_C2_HSPA1A、Treg_C3_MKI67和Treg_C4_TNFRSF4 ，接下来依旧是比较这些细胞在组间的差异。接下来，作者进一步提出了对每一个细胞计算IL2R scores，即基于CD25 (IL2RA), CD122(IL2RB), and CD132 (IL2RG)等基因（这三个基因编码跨膜蛋白，形成一个受体复合体，竞争性结合TL2(T细胞生长因子) ，以抑制效应T细胞）的表达水平来进行计算【派森诺新版高级分析也包括该项目】。然后基于这些细胞的评分比较不同Treg cluster间的差异。

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接下来作者继续使用了Monocle2来推断肿瘤内Treg的起源，分析发现 Treg_C4_TNFRSF4作为终末端来源于两种发育轨迹，其一是来源于PBMC的Treg_C1_SELL ，其二是来源于肿瘤的Treg_C3_MKI67 ，同时根据假时间轨迹分析，大多数Treg_C2_HSPA1A细胞都在肿瘤中，起源于Treg_C1_SELL细胞(常驻标记物的缺失表达可能表明最近从PBMC中招募了Treg_C2_HSPA1A细胞。

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Treg拟时序分析图
作者又结合了TCR对CD4+T 进行了进一步的讨论，在47384个CD4+T细胞中，共有17624检测到了明确的克隆型。其中Treg_C2_HSPA1A和Treg_C4_TNFRSF4克隆下数量中等。值得注意的是，在所有的CD4+T细胞中， Treg_C4_TNFRSF4的克隆细胞比例最大，这意味着克隆更为丰富。同时， Treg_C4_TNFRSF4也是在Treg细胞簇中克隆扩增最多的。同时通过差异基因表达分析可知， Treg_C1_SELL的趋化因子受体CCR4表达很高，这与NPC中CCL5、CCLC17和CCL22所对应。这些观察结果表明，与瘤内细胞的迁移能力和趋化相互作用使外周Treg_C1_SELL细胞有可能向肿瘤募集。接下来作者使用TCR补充了这个验证，观察到来自肿瘤和外周血的Treg细胞之间有少量共享的TCR 。总的来说，作者使用了拟时序分析、差异分析、配受体关系与TCR等方法共同验证了这一结论。
NPC中B细胞的多样性（B细胞亚群分析）
解析完T细胞，作者接下来对B细胞进行了讨论。作者将22892个B细胞分成了9个亚群，其中3个亚群来自PBMC ，另外6个来自肿瘤组织。

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通过差异分析可以发现肿瘤细胞特异表达的一些基因，例如干扰素诱导基因、应激基因等。接下来，作者发现B_C4_IFITM3、B_C5_ISG15和B_C6_HSPA1A等细胞亚群在“EBV感染”、“病毒的防御反应”、“病毒致癌”和“干扰素-伽马的响应” 等途径富集，暗示这三个亚群可能参与EBV感染的免疫反应。