DeepTech深科技mRNA疫苗的三道必答难题：递送、给药、专利

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1990 年， Woiff 等首次证实，体外合成的 mRNA 经肌肉注射至小鼠体内后有活性蛋白产生。这就是 mRNA 疫苗的雏形。
但 mRNA 自身稳定性差、易被体内的核酸酶降解是制约其发展的瓶颈。因此， mRNA 疫苗需要有合适的递送载体将其递送至体内，才能有更好的免疫效果，开发高效无毒的递送系统是 mRNA 疫苗成功的关键。
第一题：递送载体
相比于 DNA 疫苗， mRNA 疫苗无需进入细胞核，无整合到基因组的风险，相对更安全。 mRNA 疫苗既可作为预防性疫苗预防流感等感染性疾病，也可作为治疗性疫苗治疗如癌症等重大疾病。
目前 mRNA 疫苗主要包括非复制型 mRNA 和病毒衍生的自我扩增型 mRNA(self-amplifying mRNA ，SAM ，图 1) 。

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图丨非复制型 mRNA(A)和病毒衍生的自我扩增型 mRNA(SAM)(B)结构组成（来源：J Int Pharm Res ， Vol.46 ， No.5 ， May ， 2019 ）
非复制型 mRNA 是利用体外转录技术合，与真核生物 mRNA 分子结构一致，主要由 5'非翻译区（untranslated region, UTR）、开放阅读框（open reading frame, ORF）、3'非翻译区、5'帽子结构（Cap）和 100-250bp 多聚腺苷酸尾巴（Poly (A）)组成。 5'-UTR 和 3'-UTR 中的调节元件可稳定 mRNA 并增加抗原蛋白质翻译。 ORF 是含有编码抗原的核酸序列， Cap 能使 mRNA 沿着正确的方向进行翻译。 Poly (A）能增加 mRNA 的稳定性和抗原蛋白的表达，对 mRNA 的翻译和稳定性具有重要作用，可经 Poly(A）聚合酶添加到 mRNA 上。 mRNA 的合成一般是以含靶蛋白 ORF 的质粒为模板，经体外转录合成，最后再加上 5'Cap 和 3'端 Poly (A）。体外合成的 mRNA 进入细胞后，在核糖体上进行翻译，形成功能性蛋白。
病毒衍生的自我扩增型 mRNA（SAM）是将编码抗原的核酸序列直接插入单链 RNA 病毒中(如塞姆利基森林病毒、黄热病毒等) ，通常相对分子质量比较大，能表达大量的抗原。目前使用的 SAM 疫苗大多基于甲病毒基因组，其中编码 mRNA 复制机制的基因是完整的，只是编码结构蛋白的基因被目的基因替换，利用 DNA 模板经体外转录技术即易得到。
mRNA 疫苗递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。以慢病毒、腺相关病毒、仙台病毒等载体为主的病毒载体虽能进行核酸递送，但可能会因载体引起的免疫反应而受到限制，影响其应用。
而非病毒载体主要包括脂质体、树突细胞(dendritic cell, DC)、无机纳米粒子、阳离子细胞穿膜肽等。其中，脂质体递送 mRNA 具有独特优势: 1）脂质体为球形囊泡，可将 mRNA 包裹在内，抵御核酸酶的作用；2）脂质体类似于细胞膜，易与受体细胞融合，转染效率高；3）脂质体可递送不同大小片段的 mRNA；4）脂质体作为递送载体不受宿主限制。截至目前，脂质载体已成为递送 mRNA 最为有效的非病毒载体。常用的递送 mRNA 的脂质体材料见表 1 。

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（来源：J Int Pharm Res ， Vol.46 ， No.5 ， May ， 2019）
目前，用于递送 mRNA 的非病毒载体中以脂质体应用的最为广泛，主要包阳离子括脂质体复合物 (lipoplex ， LP)、脂质体聚合物(lipopolyplex ， LPR)、脂质体纳米粒(lipid nanoparticle ， LNP)、阳离子纳米乳(cationic nanoemulsion ， CNE) 等。
最早使用的脂质体递送材料是阳离子脂质体。带正电荷的阳离子脂质体与带负电荷的 mRNA 通过经静电作用聚集形成多层囊状复合物，称为脂质体复合物 (lipoplex ， LP) ，复合物中包封的 mRNA 不易被 RNase 降解，能被成功递送至细胞翻译成功能性蛋白。 2 - 二油酰基羟丙基 - 3-N ， N ， N - 三甲铵氯(DOTAP) 和二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE) 是已被证实有效的递送载体。