【我爱基因云】细胞凋亡检测Annexin-V

本文插图
一、实验原理
细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine ，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞， PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料
Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC） 500μl/250μl 20μg/ml
标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 ml
PBS（1×） 60/30 ml
20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头
微量离心管
可调速离心机
载玻片（用于荧光显微镜观察）
盖玻片（用于荧光显微镜观察）
去离子水
冰块
流式细胞仪或荧光显微镜
三、实验方法
1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重， 10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml ，备用。
2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS ，轻轻震荡使细胞悬浮， 1000rpm 4℃离心103．重复步骤2两次。
4．将细胞重悬于200μl 标记缓冲液。
5．加入10μl Annexin V-FITC ，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。
6．加入300μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。
四、实验结果
用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。 PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI(碘化丙啶)拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。
五、注意事项
1．整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。
3．反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。
4． Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。
附：凋亡的其它检测方法
一、细胞凋亡的形态学检测
根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测
方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜
（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
【【我爱基因云】细胞凋亡检测Annexin-V】（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。