PCR仪的使用方法( 二 ) _PCR仪如何设置

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在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。
其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪(qPCR仪) 。
荧光定量PCR仪有单通道，双通道，和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。
单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。

参考资料来源：百度百科-PCR仪

定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
实时荧光定量pcr仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。
原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。
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主要操作流程：
1、针对目的基因序列选择合适的扩增片断，设计引物。DNA引物长度：15-25 个碱基GC含量：50%左右如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争，分之内杂交。
倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的△G为负值，即：<10 kcal/mol.没有连续的G/C 。引物探针的保存一般遵循以下原则：正向和反向引物保存在-20度，浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度，最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2、输入靶序列，用进行比对；
3、检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计；
4、在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度；
5、考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。
最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染；
6、在RT步骤时，用工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低。
参考资料来源：百度百科-实时荧光定量pcr仪
参考资料来源：百度百科-定量PCR
荧光定量pcr仪有哪些品牌？进口的有：ABI的，BIO-RAD的iQ5
Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准
BIONEER：国内的用户可能听说过这个品牌的不多，只有早期较多使用进口引物的实验室和研究所或留美学者知道这个品牌。Bioneer最初是以高通量的引物合成起家，引物合成在国际上有很高的知名度。后经10几年发展产品线已覆盖整个分子生物学领域，目前同takara的产品线几乎完全一样。BIONEER的普通梯度PCR仪的价格同其他进口设备的价位比较，很具有杀伤力。这家公司也于2006年底推出了荧光定量PCR仪ExicyclerTM 96，产品技术参数也是采用96孔Peltier半导体加热，5通道，16bit CCD检测，也带有梯度功能。这款产品的参数几乎与Bio-rad的IQ5一模一样，而且检测的CCD像素还要高于IQ5, 理论上检测灵敏度应该更好一些。产品价格据说还要比Bio-rad更低一些，号称是性价比最高的荧光定量PCR仪。但是缺点是现在国内用户很少，了解起来不太容易。有兴趣的客户可以联系北京力途科技有限公司进行试用，新公司都注重是售后服务，大家毕竟要亲身体会到才是最可靠的。