染色体|乙肝CRISPR/Cas9，提供多个基因敲除，解决异质靶点及逃避突变体腺病毒|切口

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乙肝病毒慢性感染全球超过2.4亿人，可导致慢性肝炎、LC和HCC 。最近一年来， CRISPR/Cas9技术被科学家提及，有望成为直接破坏HBV基因组的一种新疗法。由于HBV基因组序列的高度多样化，异质患者的目标HBVDNA中，不一定完整地存在长度为20个核苷酸的向导RNA（gRNA）的相同靶序列。
乙肝CRISPR/Cas9 ，提供多个基因敲除，解决异质靶点及逃避突变体
【染色体|乙肝CRISPR/Cas9，提供多个基因敲除，解决异质靶点及逃避突变体】一、腺病毒载体可稳定维持八个多重gRNA表达
因为上述原因，可行的基因组编辑药物，还仅仅只对有限数量的患者有效。日本四所科研院校研究人员在International Journal of Molecular Sciences上，介绍了通过CRISPR/Cas9表达的八种多重引导RNA的腺病毒载体，能够有效破坏来自异质患者的多种乙肝病毒基因，这是最近基于乙肝研究领域应用CRISPR/Cas9技术的比较前沿的进展！
在这项研究中，研究人员发现腺病毒载体 (AdV)基因组中，稳定地维持了八个多重 gRNA表达单元。使用该 AdV表明，存在于来自异质患者的细胞染色体中的HBV X DNA可以在四个或五个预期位点同时切割，并产生不可逆的缺失。
来自：International Journal of Molecular Sciences ，使用表达 8 和 12 gRNA 的 AdV 破坏来自不同患者的 HBV X 基因二、解决以往技术问题
结果表明，尽管HBVDNA序列高度多样化，但当在HBVDNA整合位点切割细胞染色体有效时，单个 AdV可用作基因组编辑治疗的可能的抗HCC药物。同样的AdV也可用于治疗慢性或急性乙肝。虽然报告的AdV包含8个gRNA单位，但这个数字远大于使用其他病毒载体的数量：已经报告了使用慢病毒、AAV和腺病毒载体的四种多重gRNA 。
此前，全球只有报道过四种gRNA ，而本研究的AdV可同时表达八种多重gRNA 。多重gRNA表达，使我们能够使用Cas9切口酶的双切口策略，将脱靶效应降低多达1500倍。这种策略提供了更安全的基因组编辑疗法，适用于所有使用CRISPR/Cas9 系统的实验。
双切口策略，以往主要面临的一个问题是一次切割的两个gRNA都必须是有活性的，因此切割效率低的可能性增加。同时，在实验前测定所有候选gRNA的活性也就不切实际，并且可能存在影响gRNA活性的位置效应。因此，对单个目标使用两个双切口是安全的。
整合到Gx11细胞染色体中的 HBV X 基因的Southern分析，被表达8个gRNA单位的AdV破坏三、AdV相比以往更有优势
此外，如果可能，敲除一个基因的两个位点或同时破坏两个基因可以有效地使级联功能失活。出于这些原因，八单元AdV是可取的。在本研究中，表达八个多重gRNA的AdV显然更具有优势！将此策略与AAV载体一起使用是有困难的，因为saCas9的基本PAM序列NNGRRT 的频率低于 spCas9、NGG 。
在由HBV引起的HCC中，多个整合的病毒DNA通常存在于同一细胞的单个或多个染色体中。如果在一条染色体中至少存在两个靶标，并且即使病毒DNA序列中存在两个靶点，那么使用多重gRNA方法，一条染色体中两个病毒DNA之间的大量缺失或产生的两条或更多条染色体的损伤，可能会影响这些HCC细胞的生存能力。
四、未来开发前景
小番健康结语：研究人员描述了这样一项研究结论，表达八种多重gRNA的AdV是稳定的，尽管有必要检查这些AdV是否可以稳定地放大到足以用于治疗目的的规模，但它们可以应用于HBV HCC和慢性肝炎的基因组编辑疗法。它们也可能对需要同时敲除多个基因的基础研究有用。
近一年来，越来越多和CRISPR/Cas9相关研究被研究人员发表，且已有一些针对特定疾病的基因编辑药物进入临床研究。过往对基因组编辑应用于慢性乙肝的研究发现，它仅对有限的患者有效。研究人员最近开发的这种可以一步构建带有八个多重gRNA表达单元的腺病毒载体（AdV），使用它，可以切割并破坏来自异质患者整合的 HepG2 细胞染色体中的HBV X基因的多个位点！
由于序列不匹配，八个靶点中有四个不能被切割，但其余四个靶点被切割，并产生不可逆的缺失。因此，多样化的X基因被破坏效率超过90% 。含有八个多重gRNA单元的AdV ，不仅可以提供多个基因敲除，而且还可以解决基因组编辑治疗中异质靶点和逃避突变体的问题。