饲料中蛋白氮和非蛋白氮的测定有什么快速法吗？_生活广记

一、硫酸铜沉淀法
根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。但实际上，此种方法有很大的局限性。如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。
二、氨基酸测定法
为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。无论采用经典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的HPLC分析（往前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质N相比较，M至少为N的85％（M可能略大于N）。如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。
三、水解蒸馏法
1、原理：非蛋白氮主要包括五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。
2、仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。
3、试剂与溶液：6mol/l的盐酸溶液和其它常用的试剂。
4、测定方法：本文只列出用酸水解的方法。采集有代表性样品约100g ，混匀后用四分法缩分出209左右，将其粉碎，使其全部通过60目样品筛。精确称取0.3000g的样品，置于容积为60ml的试管底部（注意样品勿沾在管壁上），加入30ml 6mol/l的盐酸溶液，将试管在距试管口1～2cm处用喷灯加热并封口。将封好的试管置于干燥箱内，于110℃下水解24h 。冷却后打开试管，将水解液过滤至100ml容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然后定容至刻度。用10ml移液管移取10ml样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加入20ml 1∶1的氢氧化钠溶液蒸馏10 min，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行操作，得出样品所消耗的盐酸的体积为V1（ml）。同时作空白滴定可得消耗的盐酸的体积为V0，设所称样品的质量为M（g）。
5、非蛋白氮的粗蛋白质计算公式
CP(%)＝（V1-V0）×C×O.14×6.25/M 蛋白就用凯氏定氮法1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。
　2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
　3、想接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min 。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
计算：
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) +F*100
X：样品中蛋白质的含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积， ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积）， g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30 。
食物的种类千差万别，各种食物蛋白质的含量、氨基酸模式都不一样，人体对它的消化、吸收和利用程度也存在差异，其营养价值不完全相同。一般来说动物蛋白质的营养价值优于植物蛋白质。
在实际工作中，人们依据不同的应用目的设计了多种评价指标，但就某一种评价方法而言，因其只能以某一种现象作为观察评定指标，所以都有一定局限性。综合说来，营养学上主要从食物蛋白质的“量”和“质”两个方面来考察。即一方面要从“量”的角度考察食物中蛋白质含量的多少，另一方面则要从“质”的角度考察其必需氨基酸的含量及模式以及机体对该食物蛋白质的消化、利用程度。所使用的评价方法多种多样，总的可概括为生物学法和化学分析法。
2.4.1食物中蛋白质的含量
食物蛋白质含量是评价蛋白质营养价值的一个重要方面。蛋白质的含量是蛋白质发挥其营养价值的物质基?。?食物蛋白质含量的多少尽管不能决定一种食物蛋白质营养价值的高低，但是没有一定的数量，再好的蛋白质其营养价值也有限。
食物蛋白质含量的测定通常用微量凯氏定氮法测定其含氮量，然后再换算成蛋白质含量。食物蛋白质的含氮量取决于其氨基酸的组成以及非蛋白含氮物质的多少，可在15％～18%变动。食物蛋白质平均含氮量为16% ，故常以含氮量乘以系数6.25测得其粗蛋白含量。若要准确计算则可以用不同的系数求得。
2.4.2蛋白质的消化率
蛋白质的消化率（digestibility）是指食物蛋白质被消化酶分解、吸收的程度。消化率愈高，被机体利用的可能性就愈大。食物蛋白质的消化率用该蛋白质中被消化、吸收的氮量与其蛋白质含氮总量的比值表示。一般采用动物或人体实验测定，根据是否考虑内源粪代谢氮因素，可有表观消化率（apparent digestibility）和真消化率（true digestibility）之分。
2.4.2.1表观消化率
表观消化率即不考虑内源粪代谢氮的蛋白质消化率。通常以动物或人体为实验对象，在实验期内，测定实验对象摄入的食物氮和从粪便中排出的粪氮，然后按下式计算：表观消化率（%）＝食物氮-粪氮食物氮×1002.4.2.2真消化率真消化率（%）＝食物氮-（粪氮-粪代谢氮）食物氮×100表观消化率模糊了两个要点： ① 粪氮主要由细菌蛋白质组成，其氨基酸组成对了解不同氨基酸的消化率帮助不大；② 粪氮至少有3个来源：未消化的膳食蛋白质、由小肠黏膜脱落的蛋白质和由血液扩散到肠腔中的尿素氮。
粪代谢氮是受试者在完全不吃含蛋白质食物时粪便中的含氮量。实验首先设置无氮膳食期，并收集无氮膳食期中的粪便，测定其氮含量即粪代谢氮；然后再设置被测食物蛋白质的实验期，再分别测定摄入氮和粪氮。以粪氮减去无氮膳食期的粪代谢氮，才是摄入蛋白质中真正未消化吸收的部分，据此测定的才是该食物蛋白质的真消化率。显然，表观消化率要比真消化率(即消化率)低。
由于粪代谢氮测定十分繁琐，且难以准确测定，故在实际工作中常不考虑粪代谢氮。最近，WHO提出，当膳食中仅含少量纤维时不必测定粪代谢氮；当膳食中含有多量膳食纤维时，对成人可按每天12mg/kg的数值进行计算。
蛋白质的消化率受人体和食物等多种因素的影响，前者如全身状态、消化功能、精神情绪、饮食习惯和对该食物感官状态是否适应等；后者有蛋白质在食物中存在形式、结构、食物纤维素含量、烹调加工方式、共同进食的其他食物的影响等。
通常，动物性蛋白质的消化率比植物性的高。如鸡蛋和牛奶蛋白质的消化率分别为97％和95％，而玉米和大米蛋白质的消化率分别为85％和88％。这是因为植物蛋白质被纤维素包围不易被消化酶作用。经过加工烹调后，包裹植物蛋白质的纤维素可被去除、破坏或软化；可以提高其蛋白质的消化率。例如食用整粒大豆时，其蛋白质消化率仅约60%，若将其加工成豆腐，则可提高到90% 。
2.4.3蛋白质的利用率
蛋白质的利用率是指食物蛋白质(氨基酸)被消化、吸收后在体内被利用的程度。测定食物蛋白质利用率的指标和方法很多，各指标分别从不同角度反映蛋白质被利用的程度，现扼要介绍如下。
2.4.3.1蛋白质的生物学价值(biological value，BV)
蛋白质的生物学价值简称生物价，是机体的氮储留量与氮吸收量之比。某种蛋白质的生物价的值越高，表明其被机体利用的程度越高，最大值为100 。计算公式如下：蛋白质的生物价＝氮储留量氮吸收量＝食物氮-（粪氮-粪代谢氮）-（尿氮-尿内源氮）食物氮-（粪氮-粪代谢氮）×100式中，尿内源氮是机体在无氮膳食条件下尿中所含有的氮。它们来自体内组织蛋白质的分解。尿氮和尿内源氮的检测原理和方法与粪氮和粪代谢氮一样。
蛋白质的生物价可受很多因素影响，同一食物蛋白质可因实验条件不同而有不同的结果，故对不同蛋白质的生物价进行比较时应将实验条件统一。此外，在测定时多用初断乳的大鼠，饲料蛋白质的含量为100g/kg(10%) 。将饲料蛋白质的含量固定在10% ，目的是便于对不同蛋白质进行比较。因为饲料蛋白质含量低时，蛋白质的利用率较高。常见食物蛋白质的生物价见表2?7 。表2?7常见食物蛋白质的生物价
【饲料中蛋白氮和非蛋白氮的测定有什么快速法吗？】
蛋白质生物价蛋白质生物价蛋白质生物价鸡蛋蛋白质94大米77小米57鸡蛋白83小麦67玉米60鸡蛋黄96生大豆57白菜76脱脂牛奶85熟大豆64红薯72鱼83扁豆72马铃薯67牛肉76蚕豆58花生59猪肉74白面粉52
生物价对指导蛋白质互补以及制定肝、肾病人的膳食很有意义。对肝、肾病人来讲，生物价高，表明食物蛋白质中氨基酸主要用来合成人体蛋白，极少有过多的氨基酸经肝、肾代谢而释放能量或由尿排出多余的氮，从而大大减少肝肾的负担，有利其恢复。
2.4.3.2蛋白质净利用率(net protein utilization，NPU)
蛋白质净利用率是机体的氮储留量与氮食入量之比，表示蛋白质实际被利用的程度。因为考虑了蛋白质在消化、利用两个方面的因素，因此更为全面。NPU＝氮储留量氮食入量＝生物价×消化率除上述用氮平衡法进行动物试验外，还可以分别用受试蛋白质(占热能的10%)和无蛋白质的饲料喂养动物7～10天，记录其摄食的总氮量。试验结束时测定动物体内总氮量，以试验前动物尸体总氮量作为对照进行计算。NPU＝受试动物尸体增加氮量+无蛋白饲料组动物尸体减少氮量摄取食物氮量×1002.4.3.3蛋白质净比值(net protein ratio，NPR)
这是将大鼠分成两组，分别饲以受试食物蛋白质和等热量的无蛋白质膳食7～10天，记录其增加体重和降低体重的克数，求出蛋白质净比值。NPR＝平均增加体重（g）+平均降低体重（g）摄入的食物蛋白质（g）2.4.3.4蛋白质功效比值(protein efficiency ratio，PER)
蛋白质功效比值是用幼小动物体重的增加与所摄食的蛋白质之比来表示将蛋白质用于生长的效率。出于所测蛋白质主要被用来提供生长之需要，所以该指标被广泛用作婴儿食品中蛋白质的评价。PER＝实验期内动物体重增加量（g）实验期内蛋白质摄入量(g)此法通常用生后21～28天刚断乳的大鼠(体重50～60g) ，以含受试蛋白质10%的合成饲料喂养28天，计算动物每摄食1g蛋白质所增加体重的克数。此法简便实用，已被美国公职分析化学家协会(AOAC)推荐为评价食物蛋白质营养价值的必测指标，其他国家也广泛应用。
由于同一种食物蛋白质，在不同的实验室所测得的PER值重复性不佳，故通常设酪蛋白对照组，并将酪蛋白对照组的PER值换算为2.5，然后进行校正。被测蛋白质PER＝实验组蛋白质PER/对照组蛋白质PER×2.5几种常见食物蛋白质的PER为：全鸡蛋3.92，牛奶3.09，鱼4.55，牛肉2.30，大豆2.32 ，精制面粉0.60，大米2.16 。
2.4.3.5氨基酸评分（amino acid score，AAS）和蛋白质消化率修正的氨基酸评分（protein digestibility corrected amino acid score，PDCAAS）
蛋白质营养价值的高低也可根据其必需氨基酸的含量以及它们之间的相互关系来评价。食物蛋白质氨基酸模式与人体蛋白质构成模式越接近，其营养价值就越高。氨基酸评分则能评价其接近程度，是一种广为采用的食物蛋白质营养价值评价方法。氨基酸评分也可称为蛋白质评分和化学评分。
氨基酸评分不仅适用于单一食物蛋白质的评价，还可用于混合食物蛋白质的评价。该法的基本步骤是将被测食物蛋白质的必需氨基酸组成与推荐的理想蛋白质或参考蛋白质氨基酸模式进行比较。
为了便于评定，最初将鸡蛋或人奶蛋白质中所含氨基酸作为参考标准，因为它们是已知营养价值最好的蛋白质，并称为参考蛋白质；1957年FAO提出人的暂订氨基酸需要量模式，并以此代替鸡蛋蛋白质标准；1973年FAO/WHO有关专家委员会再次对人体氨基酸需要量进行评价而制定新的计分模式，并且认为尽管尚无实验证据表明其是否优于乳与蛋等优质蛋白质的模式，但是一般认为比全蛋或乳蛋白质的模式更为合适，并被广泛采用；1981年FAO/WHO/UNU联合专家会议，根据新近资料分别对婴儿、学龄前儿童(2～5岁)、学龄儿童（10～12岁）和成人提出了新的必需氨基酸需要量模式，与此同时再次修订了氨基酸计分模式如下： AAS（%）＝1g受试蛋白质中限制性氨基酸的毫克数需要量模式中该氨基酸的毫克数×100第一限制性氨基酸评分值即为该食物蛋白质的最终氨基酸评分。
显然，由于婴儿、儿童和成人的必需氨基酸需要量不同，对于同一蛋白质的氨基酸评分亦不相同。婴儿和儿童对必需氨基酸的需要量远比成人高。故对婴儿和儿童来说，受试蛋白质中任何一种必需氨基酸的最低分(第一限制氨基酸)，对成人而言，其蛋白质质量并不一定很低。
氨基酸评分的方法比较简单，但对食物蛋白质的消化率没有考虑。因此，1990年由FAO/WHO蛋白质评价联合专家委员会提出了一种新的方法——蛋白质消化率修正的氨基酸评分。这种方法可替代蛋白质功效比值PER对除孕妇和1岁以下婴儿以外的所有人群的食物蛋白质进行评价，并认为是简单、科学、合理的常规评价食物蛋白质质量的方法。表2?8是几种食物蛋白质经消化率修正的氨基酸评分，其计算公式为： PDCAAS＝AAS×蛋白质真消化率表2?8几种食物蛋白质的PDCAAS
食物蛋白PDCAAS食物蛋白PDCAAS酪蛋白1.00青斑豆0.63鸡蛋1.00燕麦粉0.57大豆分离蛋白0.99花生粉0.52牛肉0.92小扁豆0.52豌豆0.69全麦0.40菜豆0.68面筋0.25
从氨基酸评分可以说明鸡蛋、牛乳的蛋白质构成最接近人体蛋白质需要量模式，故其蛋白质的营养价值较高。而植物性的食物往往缺少赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸，其营养价值相对较低。值得注意的是，采用PDCAAS对大豆分离蛋白的评价可与酪蛋白和鸡卵蛋白媲美。从经济和营养价值方面考虑，使用大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白来替代或补充动物蛋白质，或者将其与其他植物蛋白质混合使用可有效提高蛋白质的质量。表2?9几种食物蛋白质BV、NPU和化学分的比较
食物蛋白BVNPU化学分PER全鸡蛋98941003.9牛奶7771953.1大豆粉7065742.3小麦6765691.5玉米6055621.2大米7770772.2明胶0000
2.4.3.6微生物测定法
利用微生物可测定酸水解后蛋白质中氨基酸的含量，也可以测定可利用氨基酸和蛋白质的质量。早先有人用产酶链球菌测定可利用的精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和色氨酸，但遗憾的是此种微生物的生长不需要赖氨酸，所以不能用它测定赖氨酸或可利用赖氨酸的总量。
近来，人们常用梨形四膜虫来进行蛋白质的营养评价。梨形四膜虫是一种可吞食食物颗粒、具有鞭毛的原生动物，其生长不完全依赖可溶性营养素。此外，它和处在生长阶段的大鼠一样也需要10种必需氨基酸（包括赖氨酸），因而优于产酶链球菌。评价方法主要是将受试蛋白质预先进行部分消化，随后在一定的条件下测定梨形四膜虫在此水解液中的生长情况，从而评定蛋白质的营养价值。据报告，对某些食物来说，四膜虫的生长与大鼠实验测得的PER值高度相关。
四膜虫法较动物实验法快速、简便，费用也低。其主要的缺点是这种原生动物对食品添加剂和调味品很敏感。
如前所述，蛋白质营养评价的方法多种多样，既有生物学的方法也有化学分析的方法。这两类方法各有利弊： ① 生物学的方法往往通过考察受试蛋白质对试验动物（特别是幼小动物，甚至是微生物）生长的贡献来评价受试蛋白质营养价值的高低。由于该方法综合考察了受试蛋白质被实验动物消化、吸收、利用的情况，因此更加全面和客观。该方法的缺点是实验动物的必需氨基酸需要量模式和人体的必需氨基酸需要量模式存在着一定的差异，将实验结果应用于人体时存在着一定的偏差。② 化学分析的方法通过分析受试蛋白质的氨基酸组成，并与人体的氨基酸需要量模式进行比较来评价蛋白质营养价值的高低。该方法所获得的结果比较直观，更易于生产和生活实践的指导。其缺点是无法考察食品加工以及混合膳食条件下食物中其他成分对受试蛋白质消化、吸收和利用的影响，这可能是化学评价和生物学评价不一致的重要原因。
总之，蛋白质营养价值评价对于食品品质的鉴定、新的食品资源的研究和开发、指导人群膳食等许多方面有重要意义。在对食物蛋白质进行营养评价时，特别是对蛋白质作系统研究或者探索一个新蛋白质资源时，应将各种方法结合起来使用，并注意以下几点：
(1) 首先测定蛋白质的含量和氨基酸模式，计算蛋白质消化率修正的氨基酸分。
(2) 若测定结果表明此蛋白质可能是一种有价值的新资源时，可进一步测定其蛋白质(氨基酸)的利用率，用生物学试验评价蛋白质的质量。
(3) 注意食品加工过程中蛋白质的变化。这通常是通过测定赖氨酸和蛋氨酸的利用率来判断，因为它们在食品加工时最易破坏。而这也可能是生物学评价低于化学评价的原因。
(4) 最好对样品中的氮、氨基酸和包括微生物毒素在内的各种毒素进行适当的分析检验，以除去非蛋白质物质的作用。
(5) 最后，应十分慎重地对受试蛋白质进行满足人体需要量方面的检验。
2.4.4蛋白质的互补作用（protein complementary action）
不同食物蛋白质中氨基酸的含量和比例关系不同，其营养价值不一，若将两种或两种以上的食物适当混合食用，使它们之间相对不足的氨基酸互相补偿，从而接近人体所需的氨基酸模式，提高蛋白质的营养价值，称为蛋白质的互补作用。例如豆腐和面筋蛋白质在单独进食时，其生物价(BV)分别为65和67，而当两者以42∶58的比例混合进食时，其BV可提高至77 。这是因为面筋蛋白质中缺乏赖氨酸，蛋氨酸却较多，而大豆蛋白质赖氨酸含量较多，可是蛋氨酸不足。两种蛋白质混合食用则互相补充，从而提高其营养价值。这种提高食物营养价值的方法实际上早已被人们在生活中采用，并且在后来的实验中得到验证。几种食物混合后蛋白质的生物价见表2?10 。表2?10几种食物混合后蛋白质的生物价
食物名称单独食用时BV混合食用所占比例（％）小麦6737—31大米77324046大豆6416208豌豆4815——玉米60—40—牛肉干76——15混合食用时BV747389
为充分发挥食物蛋白质的互补作用，在调配膳食时，应遵循3个原则：
（1）食物的生物学种属愈远愈好，如动物性和植物性食物之间的混合比单纯植物性食物之间的混合要好。
（2）搭配的种类愈多愈好。
（3）食用时间愈近愈好。因为单个氨基酸在血液的停留时间约4h，然后到达组织器官，再合成组织器官的蛋白质。而合成组织器官蛋白质的氨基酸必须同时到达才能发挥互补作用。