4.2点样 掌握好点样技术是获得清晰电泳图谱的最重要环节 。先取少量血清置于玻璃板上,用点样器(盖铝片制作)的钢口蘸取血清,然后将钢口平值“印”于点样线上(不可用力过大以避免弄破薄膜),待血清渗入薄膜后移开点样器 。注意观查血清是否均匀地分布在点样线上,若有血清扩散或血清分布不均匀则废弃,重新选用另外一张准备好(指已浸泡透)的备用薄膜点样 。
必须注意的是:点样时血清分布不均匀易导致电泳图谱不齐;点样时血清加样量过多易导致电泳图谱分离不良或中间颜色变浅;点样时血清加样量过少可导致电泳图谱染色过浅 。这些因素会影响蛋白电泳的结果分析 。因此,在实验操作时应指导学生掌握好加样量,以避免造成定量测定时产生结果误差 。
4.3电泳 将已点样的薄膜端靠近阴极,粗糙面(即点样面)向下(防蒸干影响导电)平整地紧贴于电泳槽支架的“沙布桥”上 。盖上盖子,平衡5分钟后通电 。注意,电泳槽密闭不严,薄膜易蒸干,导致电泳图谱有条痕 。
4.4通电 一般用电压130~160Ⅴ,若用电流则按照0.4~0.6毫安/厘米进
行换算 。夏季通电40~50分钟,冬季通电60分钟左右 。待电泳区带展开约3.5厘米时,将调节枢纽调至零点位置,然后切断电源 。如出现电渗现象可增大电流量克服 。但是,电流过大易导致电泳图谱有条痕 。
4.5染色漂洗 小心从电泳槽中取出薄膜,直接浸于装置染色液的玻璃槽中,并轻轻不断摇动5分钟,待能看清楚蓝色的电泳区带后,取出并用漂洗液连续漂洗,直至薄膜底色漂净为止 。即得五条蛋白色带 。从远离点样端起依次为清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白 。应注意的是染色时间不足够易导致染色后清蛋白中间颜色变浅 。
4.6定量 将漂净的薄膜用滤纸吸干,由蛋白质区带分段剪下,分别浸入装有0.4mol/LnaOH溶液的试管中,清蛋白管用4ml,其余各管为2ml 。振摇数次,约25分钟,蓝色即可完全浸出 。用721分光光度计于580~620nm波长进行比色,蒸馏水调零,读取各管吸光度数,计算出白蛋白和各种球蛋白所占百分比 。
4.7透明 如果需要保存电泳结果,可按照下列方法将薄膜透明:将染色、漂洗、干燥后(可用干燥箱干燥)的醋酸纤维素薄膜电泳图谱置于透明液中浸泡1~3分钟后取出,贴于玻璃板上,不要存在气泡 。约2~3分钟薄膜便可完全透明,待干后撕下压平整,可供长期保存和直接用于光密度计扫描分析 。
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