群体定位研究必看！百迈客BSA分析云平台详细教程( 二 ) ：群体定位研究必看！百迈客

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图3MePhyto基因的定位
4.基因表达分析
用孢子悬浮液接种ZQK9和E31幼苗，对照植株接种相同体积的无菌水，在接种0、6、12、24、48、72、96和120小时后取ZQK9和E31的根组织样品。对定位区间内8个基因进行qRT-PCR分析，发现只有MELO3C002430在ZQK9和E31表达模式发生了显著的变化，在ZQK9中， MELO3C002430在接种后表现出连续的上调表达，并且在接种后36小时达到峰值，而在E31中，在接种后没有发生显著的变化；ZQK9中MELO3C002430的表达上调表明该基因可能与抗病性相关。

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图4定位区间候选基因表达模式
5.MELO3C002430基因序列和蛋白序列分析
基因cDNA序列比对表明， ZQK9和E31间存在五个核苷酸替换，且只有一个非同义替换导致氨基酸发生了变化；基于该位点开发dCAPS标记—CAPS2430 ，在F2群体和36个种质中发现CAPS2430和抗性性状之间是共分离的；进一步分析蛋白序列分析，检测到一个与细胞壁相关的类受体激酶结构域和一个跨膜区域，另外还预测了蛋白质的二级结构；从基因序列分析验证了MELO3C002430真实性。

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图5MELO3C002430蛋白结构分析
总结
在该研究中，基因定位和功能分析使用了重测序、BSA分析、遗传定位、qRT-PCR、dCAPS标记验证，基因序列分析等测序和分子实验方法成功定位疫霉病抗性的主效基因MELO3C002430 ，解析了南瓜ZQK9抗疫霉病的分子机制。
案例二：遗传图谱+QTL定位+BSA+CRISPR/Cas9
文章题目：IdentifificationofMultipleGrainShape-RelatedLociinRiceUsingBulkedSegregantAnalysisWithHigh-ThroughputSequencing[2]
发表期刊：FrontiersinPlantScience
研究背景
粒形性状是水稻产量构成的重要因子，不仅影响水稻产量的高低，并且在籼稻和粳稻亚种之间差异也很大。粒形性状的QTLs定位等研究一直受到人们广泛的关注，至今已有许多研究报道，取得了可喜的研究进展。但是，它们的生物学机制和调控网络仍然未知。因此，鉴定和研究更多的粒形QTLs/基因不仅对阐明谷物性状调控的分子机制很重要，而且对高产和优质品种的选育也很有意义。
研究思路

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主要研究结果
1.利用RIL群体进行粒形相关QTL定位
本研究利用粒形差异较大的亲本“R99”和“沈农265”杂交得到RIL群体，然后构建该群体的重测序遗传图谱，结合粒长、粒宽、粒厚及粒重等表型性状进行了QTL定位，结果在多条染色体定位到了多个QTL ，其中5号和9号染色体上的QTL在多个环境下均定位到，而5号染色体上的QTLqGS5的LOD值在12.44~17.32 ，表型贡献率为31.38–42.13% ，说明其为主效位点，查阅文献发现， qGS5为已经报道的qSW5/GW5 ，比较两亲本的qSW5/GW5序列，结果表明，与R99相比，沈农265中在qSW5/GW5存在1212bp序列的缺失，说明qSW5/GW5可能是本研究中检测到的目标QTL ，作者继而把重点放在了9号染色体上的QTLqGS9 。

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图1表型鉴定和水稻粒形QTL的初定位
2.利用BSA对qGS9进行精细定位
基于RIL群体中qSW5/GW5和qGS9的基因型数据进行筛选，筛选到在qGS5处L155与亲本“沈农265”、L126与L52分型一致，而在qGS9处不一致，同时L155与“沈农265”、L126与L52在粒形上差异非常显著。于是，作者利用这4个材料杂交构建了两个F2群体，从中选择了粒形差异较大的个体构建DNA混池，并对混池进行重测序开展了BSA精细定位。最终把qGS9定位在了0.8Mb的区间内，对该区间进行注释，结果显示该区间含101基因，后续结合双亲差异序列分析、基因功能预测等方法，将候选基因定为Os09g0441900 。

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图2BSA群体构建

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图3BSA对qGS9精细定位
3.CRISPR/Cas9基因编辑技术进行功能验证
为了验证该基因在水稻粒形调控中的功能，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在Sasanishiki（著名的粳稻品种）的遗传背景下进行基因敲除，结果显示，突变体植株表现出半矮杆和直立的穗型结构，穗长和籽粒长度均相对于野生型减少。这些结果表明Os09g0441900基因确实参与了粒形的调控。