Southern Blot 中注意这些让你跑出更好胶片

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正文开始：

为什么要做 Southern Blot

? 定义

Southern 印迹杂交是进行基因组 DNA 特定序列定位的方法。

? 原理

利用琼脂糖凝胶电泳，分离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将胶上的 DNA 变性并在原位将单链 DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定 DNA。

? 应用

验证转基因是否成功

检测基因在基因组中的拷贝数

基因敲除检测金标准

如何获得更好的胶片？

1. DNA 质量的好坏直接影响到实验的最终结果，是整个实验中最基础也是最关键的步骤之一。

实验中，需要根据不同材料的特性，选择合适的基因组提取方法：使用相应试剂盒，或者调整提取试剂的组份，对诸如全血、细胞、动物组织、植物组织、酵母、病毒、土壤、真菌等材料，高效提取基因组 DNA。

2. 探针是一段 DNA 或者 RNA 片段（大约是 20 到 1 000 bp），用于检测与其互补的核酸序列。探针的特异性和长度直接关系到曝光结果，因此探针的制备这一步至关重要，不容忽视。

Southern 探针分为同位素标记和非同位素标记，其中非同位素标记系统主要包括地高辛标记系统和生物素标记系统。地高辛标记系统与生物素标记系统相比，由于一般不存在生物体中，因而消除了内源性背景。随着化学发光底物的运用与不断的改进，地高辛标记系统灵敏度不断增强，甚至超过放射性同位素标记系统。

Southern 杂交实验自 1975 年由英国人 Southern 创建至今，已有 40 多年了，这期间有许多的实验人员对其进行改进简化。

然而，一方面，比起最初的实验过程，如今的 Southern 已经相对简单，但是对于新手来说，Southern 的实验周期长，步骤繁琐，致使许多实验室的杂交结果并不能令人满意；

另一方面，试剂盒的价格高昂，增加了整个实验的成本，因此越来越多的有 Southern 实验需求的科研人员还是倾向于寻求第三方检测平台的协助。

实验须知

敲黑板，重点来啦，要想建好一栋 Southern 的高楼大厦，DNA 和探针的质量是关键，那么，什么样的 DNA 和探针才是高质量的，能提高胶片水准的存在呢？

DNA 样品一方面对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。同时，需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，如果电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。那么，兼具以上两个条件的 DNA 便可以来一场说走就走的 Southern 之旅了。

探针的质量高低直接决定着 Southern 的实验结果。探针设计有以下几个原则：

1. 长度适中。探针长度一般控制在 300～1 000 bp，太长时会导致非特异性结合的概率增加，太短时，探针上结合的地高辛标记物太少，会导致发光信号减弱。

2. 特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组序列的同源片段低于 30%。

ATGC 含量均匀，无发卡结构和高度重复序列。

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作者：钟鼎生物

图片来源：钟鼎

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