深度解读 | 新晋诺奖得主迈克尔·扬：我用果蝇揭开生物钟的面纱来看看迈克尔扬亲笔撰写的文章

2017年10月2日，美国遗传学家迈克尔·扬（Michael W. Young）与杰弗里·霍尔（Jeffrey C. Hall）、迈克尔·罗斯巴什（Michael Rosbash）因发现昼夜节律的分子机制，共同荣获2017年诺贝尔生理学或医学奖。

下面这篇文章，由新科诺奖得主迈克尔扬亲笔撰写，他为我们详细介绍了他的团队如何在果蝇中找出控制昼夜节律的基因。这一研究能够帮助我们更好地理解，包括人类在内多种动物的生物钟是如何工作的。

撰文 | 迈克尔·扬（Michael W. Young）

本文作者 Michael W. Young

你必须克服想在晚上7点上床睡觉的冲动，下午3点你已饥肠辘辘，但过了晚餐时间就没有任何食欲了，你凌晨4点醒来就无法再次入睡。这些情形对众多从美国东海岸飞到西海岸加州的人来说是那么熟悉，这种旅行必须经历3小时的时差。为期一周的商务旅行或度假后，你的身体刚刚才适应了新的作息时间表，而你却必须马上返回家中，去再次适应以前的例行时间表。

我和同事几乎每天都让一批果蝇经历从纽约到旧金山或从旧金山到纽约的模拟旅行的时差效应。我们实验室有几个冰箱大小的恒温箱——一个贴上“纽约”标签，另一个则贴上“旧金山”标签。恒温箱中的灯随着两个城市太阳的起落而照亮或熄灭。（为了统一起见，我们规定上午6点为日出，下午6点为日落，对两个城市都是如此。）两个恒温箱的温度都保持温和的恒定温度华氏77度（摄氏25度）。

果蝇在小玻璃管内进行模拟旅行，而玻璃管放在用一窄束红外光监测果蝇活动的特殊装置盘内。果蝇一飞进光束内，它就在装置盘上的光电晶体管上产生一个投影，而光电晶体管则连接到用于记录果蝇活动情况的计算机上。从纽约时间变到旧金山时间并不意味着我们的果蝇做了5小时旅行：我们仅仅是把放有果蝇的装置盘从一个恒温箱中拿出来，然后放入另一个恒温箱中并连接好。

我们已经利用横贯大陆的高速公路识别和研究了几种基因的功能，这些基因似乎正是生物钟构件中的齿轮，而生物钟则控制着从果蝇到老鼠和人类等大量生物的昼夜周期。识别这些基因能让我们确定它们所编码的蛋白质，而这些蛋白质则可能成为大量疾病（例如睡眠失调和季节性抑郁症）的治疗方法的标靶。

人类生物钟的主要齿是交叉上核（SCN），即脑底面一个区域（海马）的神经细胞簇。每天早上，当光刺激视网膜的时候，特定的神经就向SCN传递信号，而SCN则控制着大量生物活性物质的产生周期。例如nSCN刺激称为松果腺的一个间脑区域。根据来自SCN的指令，松果腺有规律地产生褪黑激素，即所谓睡眠荷尔蒙，现在许多保健食品商店有这种东西的药丸出售。随着白昼逐渐转为黑夜，松果腺慢慢开始产生更多的褪黑激素。随着这种激素在血液中的含量的提高，人体温度略有下降，从而增强了睡眠倾向。

人类生物钟

虽然光似乎每天都“重新启动”生物钟，但是甚至那些同光隔绝的人的昼夜节律依然继续发生作用，这表明SCN的活动是与生固有的。20世纪60年代初期，当时在德国塞维森马克斯普朗克行为生理学研究所的Jurgen Aschof及其同事揭示，自愿受试者生活在与世隔绝的地堡中，没有任何自然光，没有钟及其他有关时间的线索，然而他们大体上保持了25小时的睡一醒周期。

2000年左右，哈佛大学Charles Czeisler，Richard Kronauer及其同事已确定，人类昼夜节律实际上接近24小时，——准确地说是24.18小时。科学家研究了24位男女，其中11人20多岁，13人60多岁。他们让这些人在没有任何时间线索的环境中生活了3周多，只是人为设定了28小时的不明显的明暗周期并给受试者睡觉信号。

他们测定了受试者的体核温度（通常在夜间下降）、褪黑激素在血液中的浓度以及一种称为皮质醇的应激激素在血液中的浓度（在晚间下降）。研究人员发现，就是把受试者的白昼时间非正常地延长4个小时，他们的体温、褪黑激素和皮质醇的水平依旧按照自身的内部24小时节律时钟发生作用。更为重要的是，年龄似乎对时钟的活动没有影响：这不同于以前的研究，先前的研究指出衰老扰乱了昼夜节律，而在哈佛大学研究中，较老受试者的体温和激素含量变动都和年轻组的情形一样正常。

就像上述隔离研究所富有的启示性那样，为了研究决定生物钟的基因，科学家不得不转向果蝇。果蝇生命周期短，个体小，研究人员能在实验中培育和杂交数千果蝇，直到出现满意的变异为止，因而它们是基因研究的理想材料。为加快变异过程，科学家通常让果蝇接触被称为诱变剂的突变诱导化学物质。

20世纪70年代初期，加州理工学院Ron Konopka和Seymour Benzer识别出了揭示果蝇改变昼夜节律的第一批突变。这些研究人员喂几只果蝇吃了诱变剂，然后观察2000个后代果蝇的活动，从部分意义上说，这采用了我们现在用于“纽约一旧金山”实验的同一种装置。结果，大多数果蝇都表现出正常的24小时昼夜节律：一天中，果蝇活动12小时左右，另外12小时休息。但有3只果蝇发生了突变，打破了上述模式。其中一只的节律周期是19小时，另一只的周期是28小时，而第三只则似乎没有任何昼夜节律周期，好像是随机地休息与活动。

果蝇的定时活动

1986年，我在洛克菲勒大学的研究小组与由布兰迪斯大学的Jefrey Hall、布兰迪斯霍华德休斯医学研究所的Michael Rosbash团队一同发现，3只突变果蝇在被称为Period（或Per）的单个基因上具有3种不同的变异，而这些变异都被我们两个小组于2年前独立分离出来了。由于同一基的不同变异导致了3种不同的行为，因此，我们得出结论，Per基因在某种程度上积极参与了果蝇昼夜节律的形成和节律幅度的确定。

分离出per基因后，我们开始提出这种基因在控制昼夜周期方面是否单独起作用的问题。为了寻找答案，我实验室的两位博士后Amita Sehgal和Jeffrey Price筛选了7000多只果蝇，看是否能识别出其他的节律变异。他们最后发现，1只像具有Per基因变异果蝇的果蝇，没有明显的昼夜节律。结果证明，新突变发生在染色体2上，然而per基因被复制到了X染色体上。我们知道这必定是一种新基因，我们将其命名为timeless或tim基因。

那么新基因和per基因具有怎样的关系呢?基因是由DNA组成的，而DNA则含有制造蛋白质的指令。DNA从不离开细胞核，它的分子配方以信使RNA的形式读出，而信使RNA离开细胞核进入细胞质，蛋白质就在此形成。我们利用tim基因和Per基因在实验室里制造TIM蛋白和PER蛋白。在和哈佛大学医学院Charles Weitz的合作f1I，我们发现，当混合两种蛋白质的时候，它们就相互结合到一起，这表明它们可能任细胞内相瓦作用。

在一系列实验中，我们发现PER蛋白和TIM蛋白的生产形成了一个钟样的反馈环。在per基因和tim基因的蛋白质浓度变得足够高从而使二者相互结合之前，per基因和tim基因都是有活性的。当两种蛋白质结合在一起时，它们就形成进入细胞核的复合体，关闭制造蛋白质的基因。几小时之后，酶降解蛋白质复合体，基因重新打开，循环又一次开始。

移动生物钟的指针

当我们发现两种基因协同作用形成生物钟的时候，我们立刻开始想知道怎样重新启动生物钟。毕竟，我们的睡一醒周期完全适应跨越任何小时区的旅行，尽管调整时差可能要花两天或两周时间。

这就是我们开始在“纽约”恒温箱和“旧金山”恒温箱之间把果蝇装置盘穿梭搬动时的想法。我们和其他研究人员看到的第一批结果之一就是，不论何时将果蝇从黑暗的恒温箱搬到光芒耀眼（模拟日光）的恒温箱，果蝇脑中的TIM蛋白质都会在几分钟内消失。

更有趣的是，我们注意到，果蝇“旅行”的方向影响着TIM蛋白质的水平。如果我们在“纽约”时间下午8点（已是黑夜）将果蝇从“纽约”移至“旧金山”，此时“旧金山”时间是下午5点，依然阳光普照，果蝇的TIM水平急剧下降。但是1小时后，当“旧金山”的阳光消逝的时候，TIM开始重新积累起来。显而易见，起初，果蝇的分子钟因转移而停息下来，但停留一阵时间之后，它们又以新时区的方式重新滴答滴答地走起来了。

与此对照，果蝇下“旧金山”时间上午4点移到“纽约”时，“纽约”时间就是上午7点了，它们其间经历了一段太阳初升的时光。这次旅行也导致TIM水平下降，但这一次蛋白质不再重新形成，因为分子钟因时区转换而提前了。

通过考察tim RNA产生的时间性，我们更多地了解到了隐藏在不同分子反应后面的机制。大约在当地时间晚上8点，tim RNA的含量最高，上午6点至8点之间最低。果蝇在晚上8点从“纽约”飞到“旧金山”时产生最高水平的tim RNA含量，因而在“旧金山”接触光线而造成的蛋白质损失在“纽约”太阳落山之后极易得到弥补。如果果蝇凌晨4点从“旧金山”飞到“纽约”，那么它在出发前产生很少的tim RNA。而经历太阳初升的果蝇则消除了TIM蛋白，而使下一个形成周期开始得更早。

并非只有果蝇才如此

业已证明，对果蝇进行时滞处理对理解包括人类在内的哺乳动物的昼夜节律具有直接的意义。1997年，东京大学Hajime Tei和神户大学Hitoshi Okamura领导的研究人员以及贝勒医学院Cheng Chi Lee独立地在老鼠和人中分离出了相当于果蝇per基因的东西。1998年许多实验室参与的另一项研究发现了老鼠和人类tim基因，这些基因在上交叉核中活动。

对老鼠进行的研究还有助于回答以下的关键问题：什么因子首先触发per基因和tim基因的活动?1997年西北大学霍华德休斯医学院Joseph Takahashi及其同事分离出了他们称之为Clock的基因，当老鼠的这种基因发生变异时，就没有任何清楚的昼夜节律了。该基因编码一种转录因子，也就是一种蛋白质，在这种情形下，该蛋白质结合到DNA上并使DNA以信使RNA的形式读出。

老鼠Clock基因分离出来之后不久，几个研究小组就开始将per，tim和Clock三种基因的融合体引入哺乳动物和果蝇细胞之中。这些实验表明，Clock蛋白的靶子是老鼠的per基因以及果蝇的per和tim两种基因。这种机制具有完整的周期：对其分子钟了解得最透彻的果蝇而言，Clock蛋白同一种由称为cycle的基因编码的蛋白质一起结合到tim和per两种基因上并使其产生活性，但只有在细胞核中没有任何PER和TIM这两种蛋白质时才如此。这四种基因及其蛋白质构成了果蝇生物钟的核心，并且经过某些，改进，它们似乎就形成了控制整个动物界一从鱼类到青蛙，从老鼠到人类～昼夜节律的机制。

随后，哈佛大学Steve Repper小组及我实验室的Justin Blau开始探索联系老鼠和果蝇生物钟同各种行为、激素变动其他功能之定时性的特殊信号。某砦输出基因似乎被与CLOCK蛋白的直接相互作用所连通。与此同时，当PER和TIM两种蛋白产生中心反馈环的变动——从而形成周期性基因活动的扩展类型时，它们就阻碍Clock蛋白接通输出基因。

激动人心的前景是恢复诸如果蝇和老鼠等生物的整个时钟调节基因系统。先前没有得到描述的具有迷人效应的基因产物可能在这些网络中被发现。这些基因之一或者说分子钟的一个组成部分本身将成为缓和时滞、轮班副作用、以及睡眠失调及相关抑郁疾病之药物的标靶。总有一天，适应从纽约到旧金山的旅行会变得更容易。

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