27分文章解读:lncRNA与蛋白的爱恨纠葛

27分文章解读:lncRNA与蛋白的爱恨纠葛

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27分文章解读:lncRNA与蛋白的爱恨纠葛



在5月14日的推送中,我们详细介绍了研究RNA与蛋白质互作的实验——RNA pull down,然而,要想研究长非编码RNA通过与蛋白质结合发挥功能,仅仅通过RNA pulldown技术鉴定到有关蛋白,是远远不够的,还需要研究的问题是:



1长非编码RNA如何与该蛋白结合?

2.长非编码RNA与蛋白结合后影响了蛋白的哪些功能?



今天要和大家分享的是4月9日发表在CANCER CELL上的研究:“lncRNA Epigenetic Landscape Analysis Identifies EPIC1 asan Oncogenic lncRNA that Interacts with MYC and Promotes Cell-Cycle Progression in Cancer”。



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Cell系列杂志的特点之一就是图特别多,实验特别详细,对初接触该领域的学者来说可能并不是很友好,但其实cell的研究实验论证非常严谨,为证明同一个问题,往往会设置齐全的对照,以及使用多种实验手段进行验证,因此,看懂读透其中的实验设计对今后的课题开展将大有帮助。



下面依然采用三步法为大家做文献解读。



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1

选中一个lncRNA



通过对RNA-seq的分析找到表达差异最明显的长非,已是大家熟悉的套路,如果想从第一步就做得新颖有趣,不妨试试将其他类型的测序数据与RNA-seq的数据进行联合分析。比如今天要分享的这篇文章,研究者对lncRNA的基因甲基化水平做了全面的分析,发现一个非常有趣的现象。在许多癌症中,蛋白编码基因的启动子区CPG岛都具有较高的甲基化修饰,然而长非编码RNA却没有这样的现象。长非编码RNA的DNA甲基化水平可高可低。(下图)



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研究者将DNA甲基化的数据与RNA-seq的数据结合,鉴定了一系列由于DNA甲基化改变而发生表达量变化的长非编码RNA。其中,EPIC1的表达量最高,并且与预后相关,引起了研究者的注意。



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做表型



研究者在乳腺癌细胞系中,利用siRNA技术敲低了EPIC1,做了克隆形成,细胞增殖,细胞周期以及小鼠实验,发现敲低EPIC1可以抑制肿瘤的生长,说明EPIC1在乳腺癌中发挥癌基因的作用。



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搞机制



那么,EPIC1是如何促进癌症的发生发展的呢?研究者并没有直接通过RNA pulldown技术来寻找与EPIC1互作的蛋白质,而是对敲低EPIC1的细胞系进行了测序,通过RNA-seq的聚类分析,发现MYC的下游基因发生了显著的变化,并且qPCR也验证了这一点。



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那么,EPIC1是否通过与MYC结合,影响MYC的功能呢?此时,研究者利用RNA pulldown技术做了验证,发现EPIC1确是与MYC结合。



接下来,就是今天主要和大家分享的内容——长非编码RNA与蛋白结合后,是如何影响蛋白功能的。



要回答这个问题,首先要解析EPIC1是如何与MYC结合的。通过对EPIC1和MYC的分段克隆和RNA pulldown,研究者发现EPIC1主要通过它的129-283nt的序列与MYC的148-220氨基酸序列结合。这个实验结果看上去很炫,能将研究拉上一个档次,但是实验方法和技术并不难,只是分子克隆和RNA pulldown的结合。



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那么,长非影响了蛋白的什么功能呢?回答这个问题,需要结合蛋白本身的功能。MYC是一个转录因子,通过结合DNA影响基因的转录。而EPIC1可以影响MYC下游基因的表达,那么,EPIC1极有可能是影响了MYC与靶基因的结合。通过CHIP实验,研究者发现在敲低EPIC1后,MYC对靶基因的结合显著降低了。说明EPIC1通过结合MYC,促进MYC对靶基因启动子的结合。



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对转录因子,可以首先考虑长非与它的结合是否影响了转录因子的活性。而长非结合的蛋白多种多样,想要知道长非影响了蛋白的什么功能,其实并没有“套路”。但是,目前已证明的长非对蛋白的作用包括以下几种,参考文献也一并列出,供大家参考。



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