中国七大干细胞库细胞检测 _中国

细胞检测(中国七个干细胞库)
细胞增殖是活细胞的重要生理功能之一，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖研究的有很多。那么，今天和大家分享的检测有哪些呢？往下看不多说~
MTT检测MTT是一种黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。它可以作用于活细胞线粒体中的呼吸链。在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，四氮唑环开裂，产生蓝色甲晶。甲晶的量只与活细胞数成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，所以MTT不能降低) 。
实验 :
将接种的XXX细胞用含10%胎牛血清的培养液制成单细胞悬液，接种到96孔板中，每孔1000-10000个细胞，每孔体积为200 L 。细胞在相同的一般培养条件下培养3-5天(培养时间可根据实验目的和要求确定) 。在颜色培养3-5天后，向每个孔中加入20升MTT溶液(含PBS的5毫克/毫升) 。继续孵育4小时，停止培养，小心吸取并丢弃孔中的培养上清液，在吸取并丢弃孔中的培养上清液之前，离心悬浮的细胞。向每个孔中加入15 L优优资源网DMSO，摇动10 min，使晶体充分溶解。选择波长为490nm，测量酶联免疫传感器上各孔的吸光值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
【中国七大干细胞库细胞检测】
甲基四氮盐XTT是一种类似于MTT的四氮唑衍生物，可被活细胞的线粒体脱氢酶还原为水溶性棕甲产物。当XTT与电子偶合剂一起使用时，甲生成量与细胞增殖程度呈正相关。
实验 :
首先，制备6.6 mmol/L XTT溶液和220 mmol/L吩嗪二甲酯(PMS)溶液。使用时，将XTT和PMS按1: 1混合，形成XTT/PMS 。接种XXX细胞:用含10%胎牛血清的培养基制备单细胞悬液，每孔1000-10000个细胞接种于96孔板，每孔体积200 L 。细胞培养:与一般培养条件相同，培养3-5天(培养时间可根据试验目的和要求确定) 。在培养结束前2小时，向每个孔中加入XTT/PMS 20L，然后培养2小时。以655纳米为参比波长，在450纳米处测量吸光度。
WST一号该是一种高灵敏度、高稳定性、无放射性的比色检测，用于细胞增殖或毒性试验中测定活细胞数。与MTT、XTT、MTS等其他四氮唑盐相比，实验灵敏度更高，线性范围更宽。
实验 :
将100 L/孔的XXX细胞(约1104个)加入到96孔板中，在37℃的5% CO2细胞培养箱中培养24小时。加入适当浓度的测试化合物。将96孔板在含有5% CO2空气体和100%湿度的细胞培养箱中于37℃孵育适当的时间。使用WST-1细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒，向每个孔中加入10 L四唑盐工作溶液。37℃孵育1 ~ 4小时。用酶标仪在450nm波长下检测每个孔的光密度。
八国集团(WST八国)CCK-8是近年来新开发的水溶性四氮唑盐检测法。其原理与WST-1相似:在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪酯(1-甲氧基PMS)的作用下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为橙黄色的水溶性高的甲。产生的甲量与活细胞数成正比，酶联免疫吸附法测得的吸光值可以间接反映活细胞数。在一定的细胞数范围内，甲的量与细胞数成正比。
实验 :
将细胞悬浮液(100 L/孔)接种到96孔板中。培养板在培养箱(37℃，5% CO2)中预培养。细胞被处理后。向每个孔中加入10 L CCK溶液(注意不要在孔中产生气泡，它们会影响OD值的读取) 。将培养板在培养箱中孵育1 ~ 4小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度。若OD值暂不测定，可在每孔中加入10L 0.1M HCl溶液或1%w/v SDS溶液优优资源网，将培养皿盖好，避光室温保存。24小时内，吸光度不会改变。
克隆形成平板形成试验简单，适用于贴壁细胞。合适的基质是玻璃瓶和塑料瓶。实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散好，不能有细胞团，接种密度不能太高。
实验 :
对数生长期单层培养的XXX细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹成单细胞，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。以梯度倍数稀释细胞悬液，并以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般以每皿50、100、200个细胞的梯度密度接种于含10ml 37℃预热培养液的培养皿中，轻轻旋转使细胞分散均匀。将其置于37℃±5% CO2和饱和湿度的环境中，培养2 ~ 3周。当培养皿中出现可见克隆时，培养终止。弃去上清液，小心地在PBS中浸泡2次。加入5mL纯甲醇或1:3的乙酸/甲醇，固定15分钟。然后去掉定色剂，加入适量姬姆萨，涂染液10 ~ 30min，再用流水慢慢洗掉染液，用空气体吹干。将平板倒置，用网格覆盖一层透明膜，用肉眼直接计数克隆数，或在显微镜(低倍镜)下计数50个细胞以上的克隆数。最后，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数100% 。
软琼脂克隆形成软琼脂培养法常用于检测肿瘤细胞和转化细胞系。琼脂与细胞混合时，琼脂的温度不能超过40℃ 。接种细胞的密度不超过每平方厘米35个，一般1000个细胞接种在6cm的培养皿中。正常细胞在悬浮液中不能增殖，因此不适合软琼脂克隆形成试验。
实验 :
取对数生长期优优资源网XXX细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后轻吹成单细胞，计数活细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1106细胞/L 。然后根据实验要求进行梯度倍数稀释。用蒸馏水分别制备1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖溶液。高压灭菌后，它们不会在40℃固化。将1.2%琼脂糖与2DMEM培养基(含2种抗生素和20%小牛血清)按1:1的比例混合后，取3mL混合液注入直径为6cm的培养皿中(10cm皿中加入7 ~ 10 ml)，冷却凝固，即可作为CO2培养箱中的底层琼脂备用。将0.7%琼脂糖和2DMEM培养基按1:1的比例混合在无菌试管中，然后向试管中加入0.2mL细胞悬液，充分混合，倒入装有1.2%琼脂糖的底板中，逐一形成双层琼脂层。上层琼脂凝固后，置于37℃±5% CO2培养箱中培养10 ~ 14天。将平板置于倒置显微镜下，观察细胞克隆的数量。计算形成速率。
溴脱氧尿苷BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，通常用于标记活细胞中新合成的DNA 。它可以选择性地整合到复制细胞中新合成的DNA中，而不是胸腺嘧啶(细胞周期S期) 。这种掺入可以稳定存在，并随DNA复制进入子细胞。BrdU特异性抗体可用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。
实验 :
将细胞密度为1.5105个/mL的XXX细胞接种于直径为35 mm的培养皿中(内部放置盖玻片)，培养1天，用0.4%FBS培养基同步培养3天，使大部分细胞处于G0期。加入BrdU(储备液:1.0毫克/毫升，最终浓度:0.03克/毫升)，在37℃孵育40分钟。丢弃培养液，用PBS洗涤载玻片3次。甲醇/乙酸固定10分钟。固定玻片空气体干燥后，用0.3%H2O2-甲醇灭活内源氧化酶30分钟。5%正常兔血清被阻断。100℃甲醛变性核酸5min 。冰浴冷却后，用PBS洗涤，加入小鼠BrdU单克隆抗体(工作浓度1: 50)，加入PBS或血清作为阴性对照。根据免疫组织化学中常用的ABC法，使用苏木精或曙红进行检测。在显微镜下随机计数10个高倍视野中的细胞总数和BrdU阳性细胞数，计算标记指数LI 。
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