elisa试剂盒实验原理 _什么是elisa试剂盒

elisa试剂盒实验原理上海科艾博生物（COIBO）科技
从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异相固相酶免疫技术。所谓异相是指在检测时不需要将酶标记抗原抗体和游离抗原抗体分开，所谓固相就是指的ELISA的96孔板固相载体了。看下面均相酶免疫测定的原理图：
ELISA的主要原理很简单，有这么三个，1、包被抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，可能原理是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性；2、标记抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点；3、显色酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。ELISA 实验设计根据检测对象的不同，我分别给童鞋们介绍抗原的检测方法设计和抗体的检测方法设计。抗原的检测设计1、双抗夹心法针对至少2个抗原决定簇的多价抗原。首先介绍一下抗原决定簇，抗原决定簇就是决定抗原性的特殊化学基团，也叫抗原表位，理论上一个抗原决定簇能诱导产生一种单克隆抗体（可能有童鞋又要问单克隆抗体是神马东东了，以后介绍啊）。由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（线性表位）组成或由不连续的蛋白质三维结构（构象表位）组成。临床上具有2个抗原决定簇的多价抗原有很多，比较常见有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。检测步骤也简单，就是包被、洗涤、加样、洗涤、加样、洗涤、显色。具体说来是先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，再加入待测样品，若其中含有待测抗原就会与固相抗体结合，洗掉杂质后，再加入酶标记的检测抗体进行反应，洗掉多于的酶标抗体后，加入底物显色，显色与否以及颜色的深浅就代表了待测抗原是否存在以及相对含量了，简单吧。
对于双抗夹心法检测大分子抗原要注意几点，1.固相抗体和酶标检测抗体一定是分别针对待测抗原的两个不同抗原决定簇，不然两个抗体就会为争同一个决定簇而打架，会出现假阴性的不良结果；2.如果检测的样本是血清，就要注意风湿病患者体内内风湿因子RF这种奇葩异种抗体的存在，它能够神奇地结合固相抗体和检测抗体，造成假阳性的不良结果；3.包被的固相抗体含量一定是高于样品中的抗原含量，不然检测到的含量会比实际含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，将待测样品与酶标检测抗体同时加入固相载体，在酶标检测抗体高于样品中的待测抗原的情况下，会出现假阴性结果，这种现象书本叫钩状效应。2、竞争法针对小分子抗原。这种方法也可以用于大分子抗原，只是相对双抗夹心法这种强悍的策略，竞争法完全没有优势，所以竞争法只在检测小分子这个边缘地带发挥余热了。临床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及药物等。检测步骤与双抗夹心法更简单，包被、洗涤、加样、洗涤、显色，少了一步加样的过程，但是设计上复杂一些，首先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，然后每组样本需要分两组，一组同时加入事先混匀好的酶标检测抗原和样本的混合物，一组只加入酶标记抗原，两组颜色只差便是待测抗原的含量，有点晕啊。
对于竞争法也需要注意一点，酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好，然后同时加入固相载体，不然会造成不公平竞争，检测出现偏差；抗体的检测设计就方法来说，有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计。1、间接法，这个是检测抗体最常用也最简单的方法。操作步骤与双抗夹心一样，只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了，加入样品后洗涤，再加入的酶标记抗抗体，然后显色，颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的，为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了，以此类推，之前的双抗夹心法也可以叫做直接法，命名其实就是这么回事，规则多了就容易让人糊涂。间接法也有一些自己的特点，1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型，可用于鉴别感染时期，如果是IgM那么提示感染早期；2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高，容易产生假阳性，如果封闭不完全，可出现全板阳性，挺吓人的。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等。