干货：反义lncRNA分子模型及实验方法
原标题：干货：反义lncRNA分子模型及实验方法
在真核生物中 ， 长链非编码RNA（lncRNA）表达现象非常普遍 ， 也是近年来的研究热点 。 其中 ， 有一类lncRNA较为特殊 ， 称为编码基因的反义lncRNA（AS-lncRNA） ， 占比也是最大的（约占总lncRNA的40%） ， 它们邻近编码基因（基因前、基因中、基因后） ， 但转录方向与编码基因相反；在功能上 ， AS-lncRNA在基本生物学过程（包括胚胎多能性 ， 分化和发育）中显示出多重作用 ， 并且与疾病的发生发展密切相关 。 
文章图片
那么 ， AS-lncRNA具体功能有哪些 ， 以及如何通过实验研究的呢？
AS-lncRNA通过ceRNA机制调控基因表达前列腺癌（PCa）是全球主要的男性恶性肿瘤之一 ， 研究者欲分析lncRNA与PCa的关系 ， 从TCGA数据库获得了高表达的FOXP4-AS1：
文章图片
D.64例FOXP4-AS1高或低的PCa患者的总生存期；E.患有早期或晚期肿瘤的PCa患者中的表达水平；F.正常细胞RWPE-1与PCa细胞表达水平
通过细胞及动物实验 ， 论证了FOXP4-AS1高表达对PCa的增殖促进能力：
文章图片
为了研究FOXP4-AS1在PCa中的调控模式 ， 通过FISH实验确认了FOXP4-AS1主要位于细胞质 ， 因此 ， FOXP4-AS1应该是转录后调控 。 ceRNA是lncRNA的常见转录后调控模式,FOXP4-AS1是否具有miRNA结合能力呢？接下来 ， 进行Ago2-RIP分析（Ago2是miRNA结合蛋白 ， Ago2能沉淀下lncRNA ， 说明miRNA可以与lncRNA结合） ， 发现FOXP4-AS1与FOXP4均有miRNA结合潜力：
文章图片
进一步运用starbase数据库 ， 筛选出五个可能与FOXP4-AS1和FOXP4结合的miRNA ， 并通过双荧光素酶实验证明了miR-3184-5p与两者的结合：
文章图片
在两个PCa细胞中进行了拯救试验（是为了说明三者存在竞争结合） 。 细胞增殖测定表明 ， miR-3184-5p上调或FOXP4下调逆转了FOXP4-AS1过表达对LNCaP细胞增殖的影响 。 此外 ， 抑制miR-3184-5p的表达或抑制FOXP4的过度表达可减弱sh-FOXP4-AS1对PC-3细胞增殖的影响 ， 这就说明lncRNA是通过调控另外两者而影响细胞表型 。 
文章图片
AS-lncRNA通过与启动子互作调控基因表达SATB2-AS1在结直肠组织中特异性表达 ， 并在结直肠癌（CRC）中下调 。 生存分析表明 ， SATB2-AS1表达降低与生存能力差有关 。 
文章图片
通过pulldown ， 将下拉产物进行质谱分析 ， 获得了与lncRNA结合的分子为WDR5和GADD45A ， 前者是组蛋白H3K4甲基转移酶复合物的核心亚基 ， 而后者参与维持基因组稳定性和DNA修复 ， 并且在DNA脱甲基激活中起关键作用 ， 两个蛋白都是染色质调节因子 。 
文章图片
因为下拉的蛋白与甲基化有关 ， 所以针对SATB2启动子区域进行亚硫酸氢盐测序以及H3K4me3-chip ， 以检测CRC和正常组织中的CpG岛甲基化状态 。 发现R3和R4区两个区域甲基化存在差异 ， 从而导致了SATB2基因表达变化 。 
文章图片
因此 ， SATB2-AS1通过调节SATB2启动子的DNA去甲基化和H3K4me3富集达到促表达的效果 。 
文章图片
CRC中SATB2-AS1的拟议机制示意图
AS-lncRNA通过直接互作改变mRNA的半衰期针对五个胃癌（GC）细胞系和正常组织进行RNA测序 ， 筛选到MKN28和KATOIII这两个KRT7-AS表达升高 。 该lncRNA在基因座上与KRT7mRNA中的第七外显子含有213bp的重叠区（OL）：
文章图片
将KRT7-AS过表达后 ， KRT7蛋白表达量有明显的提升：
文章图片
但是 ， KRT7的mRNA水平没有明显变化：
文章图片
上述实验说明 ， lncRNA不是作用于转录前的作用 ， 也就排除启动子、增强子等机制 。 作者进一步验证了RNA的半衰期 ， 通过使用α-amanitin阻断新的RNA合成 ， 检测KRT7的mRNA半衰期,发现 ， 过表达KRT7-AS之后 ， KRT7的mRNA降解速度减缓：
- 不同肤质的定妆产品怎么选？定妆原理解析，值得收藏的定妆干货
- 为什么炒股赚钱这么难？这篇干货告诉你答案
- 干货, 股票的真突破和假突破, 本文给你明细的解答
- 【干货】Linux运维跳槽必备的30道面试精华题（上）
- 影视剪辑，如何利用热搜一个月赚3万多？详细干货，记得收藏！
- 办公干货：电脑高手推荐的十二个快捷键一键快速锁屏一键秒开文件管理一键回到桌面快速恢复被关页面永久删除文件快速打开菜单栏快速截取全屏快速关
- 爱媛38号栽培技术与管理——干货满满，学起来
- 集饰装修丨干货！家里装修窗台石有必要装吗？爆点来了
- 干货丨麦克风支架种类及购买指南，适合直播、录音、K歌
- 干货丨一款昂贵的话放，能够改善你的音质吗？