原标题：NatureMethods：刊发全新的circRNA的下调方法
上个月初 ， 吉凯针对circRNA的研究作了一场直播讲座 。 当时小陈老师总结了下调circRNA的方法 ， 分别是shRNA、Crispr-Cas9和ASO ， 详情大家可以点击此处去B站查看 。
但是 ， 我们必须承认 ， 这几种方法下调circRNA方法都有一定的局限性 。 第一种 ， shRNA的方法靶点设计范围小 ， 一旦无效很难进一步设计靶点 ， 可能脱靶到亲本线性RNA 。 第二种 ， CRISPR-Cas9系统如果敲除circRNA所在外显子很可能会影响亲本线性mRNA的功能；如果敲除circRNA两侧内含子序列 ， 可能无法有效敲低circRNA ， 也有可能会影响亲本mRNA的表达水平；同时CRISPR-Cas9需要挑选单克隆 ， 实验流程复杂 。 第三种 ， ASO面临表达时间短 ， 部分细胞转染困难 ， 难以用于体内实验等问题 。
是否还有新的方法可以应用到circRNA的下调 ， 且局限性更小呢？
2021年1月下旬发表在Naturemethods的文章“ScreeningforfunctionalcircularRNAsusingtheCRISPR-Cas13system”向我们介绍一种全新的circRNA的下调方法 。
研究背景
最近的很多研究已经发现 ， 在哺乳动物细胞中 ， RNA靶向的VI型CRISPR效应分子 ， 包括Cas13a、Cas13b、Cas13d ， 能够在gRNA介导下切割靶向的单链RNA序列 。 VI型的CRISPR-Cas系统需要22nt-30nt的gRNA来介导有效的敲低；相比于RNAi有更高的特异性 ， 对于和靶点RNA的错配 ， 耐受度非常低 。
实验方案
作者首先构建了不同物种的Cas13 ， 然后分别在不同细胞设计同样的gRNA ， 比较敲低效率 ， 甄选出敲低效率最高的Cas13蛋白 。 然后利用不同的gRNA设计方案 ， 研究gRNA的位置、长度、单（双）碱基不匹配等 ， 对于circRNA敲低效率的影响 ， 并同时检测是否影响线性亲本mRNA的表达 。
【Nature Methods：刊发全新的circRNA的下调方法】在验证了CRISPR-Cas13这个工具的有效性之后 ， 作者利用这个系统设计一个cicRNA敲低文库 ， 用来筛选可能影响细胞增殖的circRNA 。
实验结果
首先 ， 利用LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、RfxCas13d这几个Cas13蛋白分别敲低KRAS和circPOLR2A、circRTN4这几个基因后 ， 研究者发现RfxCas13d拥有更高的敲低效率 。 随后作者利用RfxCas13d去敲低另外八个circRNA ， 发现敲低效果都很明显 ， 且不影响亲本线性mRNA的表达（图1） 。


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图1.CRISPR-RfxCas13d敲低不同circRNA
由于在CRISPR-Cas13发现之前 ， shRNA是下调circRNA的主要手段 ， 因此作者比较了在多个circRNA上这两种敲低方法的效率 。 在9个不同的circRNA中 ， 作者发现CRISPR-Cas13系统有着更高的敲低效率和更好的特异性 ， 更少地脱靶到线性mRNA上（图2） 。


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图2.shRNA和CRISPR-Cas13敲低circRNA效果比较
进一步地 ， 作者又研究了gRNA长度对于敲低效率的影响 ， 在设计的一系列16-36nt的靶点中 ， 作者发现当gRNA长度超过18nt时 ， 靶点才逐渐发挥作用 ， 当靶点长度达到22nt及以上时 ， 敲低效果最高（图3） 。


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图3.不同长度的gRNA对于敲低效率的影响
随后 ， 通过在靶点的不同位置引入突变 ， 研究其对敲低效率的影响 ， 从而来验证CRISPR-Cas13系统的特异性 。 结果发现 ， gRNA对于-8~8位置出现错配更为敏感 ， 会极大地影响敲低效率（图4） 。


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图4.gRNA序列错配对于敲低效果的影响
在完成了对于CRISPR-Cas13系统靶点设计特性的研究后 ， 作者针对人源细胞中占据表达前10%的circRNA ， 利用Cas13系统定制一套敲低文库 。 分别在HT29、Hela、293FT细胞中筛选与增殖相关的circRNA 。 简要流程为 ， 在表达RfxCas13d的HT29、Hela、293FT细胞稳定株中 ， 以0.3的moi感染gRNA文库慢病毒；感染后持续培养30天 ， 期间分别收取D1和D30的细胞 ， 每组两个平行重复 ， 提取基因组DNA测序gRNA的变化 。 最后作者筛选到 ， 在HT29、Hela、293FT中 ， circFAM120A的敲除都将明显抑制细胞的增殖（图5） 。 后续通过研究 ， 作者证明 ， circFAM120A通过抑制IGF2BP2和FAM120A结合 ， 促进FAM120A翻译 ， 从而促进细胞增殖 。


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图5.circFAM120A敲低抑制HT29、293FT、Hela细胞增殖
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