《JACS》模型网络水凝胶，可扩展的一锅液相寡核苷酸合成( 二 ) 【背景介绍】DNA基序提供了一

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图1.比较当前文献方法（左）与一锅核苷酸加成方法（右）的液相on-PEG寡核苷酸合成。
4-臂PEG-T20的多重谱合成
建立用于将第一个T核苷酸添加到4臂PEG-OH上的OP-LPOS技术后，使用该技术为具有目标20个核苷酸序列的可编程DNA材料制备了高质量的构建基块。为了合成4臂PEG-T20 ，作者将OP-LPOS进行20遍4臂PEG-OH（Mn ， MALDI=41170g/mol ， ?=1.04）（图2a）。每个偶联步骤均使用3倍过量的亚磷酰胺和12倍过量的ETT与OH基团进行60分钟，分别以100和250mM的无水乙腈溶液形式添加。为了监测T20的生长，在每个步骤之后，对中间样品进行DMSO-d6NMR光谱测量，最终1HNMR光谱显示产物不含杂质（图2c）。与PEG相比， T的量略高于在随后的合成步骤中预期的量，其来源将在下面进一步讨论。最初的18.9g规模合成，得到9.0g4臂PEG-T20（图2b），整个合成过程中总共收集了10.2g样品。

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图2.通过重复20次的OP-LPOS从4臂PEG-OH合成4臂PEG-T20 。
【《JACS》模型网络水凝胶，可扩展的一锅液相寡核苷酸合成】合成中去嘌呤的抑制
构建侧重于由两个相互作用的4臂PEG-DNA星型聚合物形成的模型网络的DNA材料需要合成互补的4臂PEG-A20 。实际上，具有大量腺嘌呤核苷酸的序列（在这种情况下，每4个臂PEG为80个）仍然是LPOS的主要瓶颈，因为酸催化的去三苯甲基化所需的长时间酸暴露时间会引起去嘌呤化（去除腺嘌呤或鸟嘌呤核苷碱基）;均为嘌呤核苷碱基）。反过来导致后处理断链（图3a）。特别地，最普通的A-核苷酸亚磷酰胺（具有苯甲酰基保护基）易于去纯化。在SPOS中这无关紧要，因为连续冲洗掉裂解的DMT基团会加速部分可逆的脱保护作用（图3b），并使酸暴露最小化。为了解决此问题并促进4臂PEG-A20的合成，作者首先讨论了OP-LPOS的优化，以防止苯甲酰基保护的A的去纯化作用。为了优化OP-LPOS并最大程度地减少脱嘌呤，因此确定了在一锅添加苯甲酰基保护的A-亚磷酰胺到4臂PEG-OH中各种条件下的脱三苯甲基化和脱嘌呤反应速率。通过在一定时间间隔内收集样品并测量1HNMR来监测去三苯甲基化和去嘌呤的程度，以确定PEG端基对PEG臂的DMT（4H）和腺嘌呤（2H）的残留量（图3c和3d突出显示彩色的箭头）。这两个反应均遵循一阶动力学且具有较高的准确度（图3e）。

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图3.抑制腺嘌呤核苷酸的去嘌呤副反应。
4-臂PEG-A20克数量级规模的合成
4-臂PEG-A20的合成以与4-臂PEG-T20类似的方式进行，但是主要区别是去三苯甲基化条件。作者从相同的4臂PEG-OH（Mn ， MALDI=41,170g/mol ， ?=1.04）开始，并用Bz保护的A-亚磷酰胺再次重复OP-LPOS20次（图4a）。经过20个单锅核苷酸添加步骤后，加入10.1g的4-臂PEG-OH ，分别得到3.4g带有腺嘌呤和磷酸盐上的Bz和CE基团的4-臂PEG-A20（图4b），以及一个附加的在整个合成过程中收集到4.1g样品。图4c显示了不含杂质的最终产物（腺嘌呤和磷酸盐保护的）的1HNMR光谱。与上述相似， 4臂PEG-A1-20的HPLC色谱图（在AMA溶液中脱保护2小时，然后用磷酸盐缓冲液稀释）描绘了在整个合成过程中出现的少量寡聚A杂质（图4d）。类似于4臂PEG-T20的合成，寡聚A杂质的量很小，直到15个核苷酸为止，并在最后一步增加。

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图4.通过重复20次的OP-LPOS从4臂PEG-OH合成4臂PEG-A20 。
4臂PEG-DNA模型网络
通过高质量和大规模地获得4臂PEG-T20和4臂PEG-A20 ，作者证明了这种结构单元在互补结构单元的DNA双链杂交交联的超分子模型网络水凝胶中的应用（图5a）。由于具有定义的网络拓扑，由A-B功能性4臂构件构建的超分子网络提供了对键动力学的独特见解。由互补的DNA序列构成的水凝胶还可以使网络融化和冷却，从而通过缺陷退火确保理想的拓扑结构。水凝胶（几厘米3的碎片）可以熔化并倒入各种形状，而在室温下没有可见的流动（图5b）。流变仪中f=1Hz处的温度扫描显示在44°C下储能模量G'和损耗模量G''的交叉（图5c），这与凝胶到溶胶的转变相对应。

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图5.由4-臂PEG-T20和-A20构建单元形成的模型网络水凝胶。