《JACS》模型网络水凝胶，可扩展的一锅液相寡核苷酸合成【背景介绍】DNA基序提供了一

【背景介绍】
DNA基序提供了一个强大的工具箱，可用来模仿生物系统的功能复杂性。确实，当前具有DNA连接主题的材料在诸如软机器人，治疗和细胞培养水凝胶，可编程荧光机械传感以及响应生物输入的材料等应用中显示出越来越先进的性能。但是，目前缺乏对寡核苷酸结构单元的大规模合成途径阻止了DNA材料的广泛应用。尽管在生物技术生产和复制技术方面取得了重大进步，但用于DNA和RNA的最广泛，最通用的合成技术是基于亚磷酰胺化学的固相寡核苷酸合成（SPOS）。使用不溶性支持物在自动合成仪上进行4步核苷酸加成循环-偶联，帽化，氧化，脱保护/去三苯甲基化。这种流化学方法的异质性有助于快速自动合成多达200个核苷酸的序列，但存在一些可扩展性限制（尤其是在实验室环境中）和较高的试剂消耗。作为一种替代策略，液相寡核苷酸合成（LPOS）使用均质反应混合物，原则上具有无限的可扩展性，并且需要的试剂过量非常少。在LPOS中，寡核苷酸是从可溶性支持物中生长出来的，可在每个步骤后通过沉淀，萃取，色谱或纳滤将其从反应混合物中分离出来。其中最突出的方法是高效液相（HELP）方法，它使用聚乙二醇（PEG）载体，该载体在每个步骤后都会沉淀出来。

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【科研摘要】
基于亚磷酰胺化学的固相寡核苷酸合成（SPOS）是目前最广泛的DNA和RNA合成技术，但存在可扩展性限制和试剂消耗高的问题。液相寡核苷酸合成（LPOS）使用可溶性聚合物载体，具有可扩展的潜力。但是，目前， LPOS每添加一个核苷酸需要3个独立的反应步骤和4-5个沉淀步骤。此外，由于脱嘌呤和链断裂，在脱保护步骤期间长的酸暴露时间使具有高A含量（腺嘌呤）的序列降解。先前，弗莱堡大学AndreasWalther教授团队提出了第一个单锅液相DNA合成技术，该技术允许在一锅中依次偶联，氧化和脱保护的一个反应中添加一个核苷酸，然后进行单个沉淀步骤。相关论文ScalableOne-Pot-Liquid-PhaseOligonucleotideSynthesisforModelNetworkHydrogels发表在《J.Am.Chem.Soc.》上。此外，作者展示了如何在添加腺嘌呤核苷酸的过程中抑制去嘌呤。作者展示了该技术在克数制下制备高纯度4臂PEG-T20（T=胸腺嘧啶）和4臂PEG-A20构件的潜力。这种互补的4-臂PEG-DNA构件可逆地自组装成超分子模型网络水凝胶，并有助于阐明键的寿命。这些模型网络水凝胶在室温下（在44°C的温度下熔化）在DNA键中展现出新的机械性能水平（储能模量，键寿命），从而为通过序列识别可编程的下一代DNA材料开辟了途径，可用于大规模应用。

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作者提出了一种单液液相寡核苷酸合成（OP-LPOS）的第一种合成策略，并使用此方法制备了两个不同的4臂PEG-DNA构建基块，每个臂中有20个寡核苷酸，在10–20g秤（示意图1）。将一个核苷酸添加循环所需的三个步骤（偶联，氧化和去三苯甲基化）合并为一锅法，并依次添加试剂，通常仅需一次沉淀即可在完全添加一个核苷酸后以高纯度回收产物。作者专注于胸腺嘧啶和腺嘌呤同系重复序列，因为它们允许通过双链体形成进行互补相互作用，并且因为腺嘌呤在脱嘌呤和链断裂方面是最具挑战性的碱基。确实，作者对条件，试剂和取代效果的详细研究使人们可以抑制A核苷酸的去嘌呤和主链裂解，并可以清洁液相合成4臂PEG-A20 。然后，将这些互补的组成部分（4臂PEG-T20和4臂PEG-A20）组合在一起，以研究杂交的T20-A20双链体，将其作为具有出色机械强度的自立模型网络水凝胶的机械连接。

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示意图1.在4-ArmPEG上进行一锅液相寡核苷酸合成（OP-LPOS）的概念。
【图文解析】
一锅寡核苷酸添加
液相寡核苷酸合成（LPOS）的主要瓶颈是每个步骤中试剂的不相容性，以及在偶联，氧化和去三苯甲基化步骤后需要重复沉淀和过滤，这是劳动密集型的，并导致产品损失。作者对已建立的在偶联后直接在一锅法中直接继续进行的方法的主要改进是替换了常用的氧化剂叔丁基过氧化氢（TBHP），文献报道该化合物可氧化分离出的偶联产物，随后通过另一个沉淀步骤（图1a–c）。确实，首先尝试通过在耦合步骤后将TBHP直接添加到反应混合物中而不除去过量的亚磷酰胺或ETT的方式，在一锅耦合和氧化中进行经典TBHP 。但是，通常使用过量50倍的TBHP（相对于亚磷酰胺）会导致副产物的形成（图1d–f ，顶部）。最后的反应步骤是去除DMT保护基（去三苯甲基化）。这是一个挑战，因为它是一个平衡反应，通常会导致LPOS中的不完全三苯甲基化（图1g）。