|Nature子刊：升级版PROTAC，来了

用药物调控参与癌症形成和发展的特定蛋白的降解是一种新兴的抗癌策略。蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis-Targeting Chimeras ， PROTACs)是该领域最热门的技术之一。这类蛋白降解剂分子结构看起来像哑铃一样，通过一个“连接器“（linker）连接“兴趣蛋白的配体”以及“E3泛素连接酶的招募配体” 。也就是说， PROTAC分子的一端与兴趣蛋白（即靶蛋白）结合，另一端与E3泛素连接酶结合。而E3泛素连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白。之后，细胞的蛋白粉碎机（即， 26S蛋白酶体）会识别和降解被标记的靶蛋白。
不过，尽管PROTACs技术具有靶向传统上不可成药的靶点、克服蛋白抑制剂耐药性等优势，但这类分子的开发仍有很多需要优化的方面，例如为靶蛋白选择更合适的E3连接酶、改善靶蛋白与E3连接酶的结合亲和力、优化PROTACs的linker等。此外，由于PROTACs的分子量较大，它们的细胞摄取也是一个亟待改善的问题。在细胞内积累能力有限大大影响了它们的效用。

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来源：Nature Communications
【|Nature子刊：升级版PROTAC，来了】8月26日，最新发表在Nature Communications杂志上的一项研究中，由贝勒医学院Jin Wang博士带领的团队报道了一项令人兴奋的发现。他们开发出了一种改进版的PROTACs ，这款新型PROTACs增强了细胞内积累能力和效应功能，且是一个既可作为降解剂，同时也是抑制剂的双功能分子。
Jin Wang博士是贝勒医学院药理学和化学生物学及分子和细胞生物学副教授，他和同事对提高PROTACs降解细胞内靶蛋白的能力很感兴趣。在这项研究中，通过比较可逆非共价(reversible noncovalent, RNC)、可逆共价( reversible covalent, RC)和不可逆共价(irreversible covalent ,IRC)“弹头”（PROTAC中结合靶蛋白的部分）对BTK降解的影响，他们偶然地发现，基于氰基-丙烯酰胺的（cyano-acrylamide-based）可逆共价化学过程能够显著增强PROTACs的细胞内积累及其与靶点的结合。他们所开发的可逆共价BTK PROTACs——RC-1能够达到非常高的靶点占有率，可同时作为降解剂和抑制剂发挥作用。
据论文描述，目前被报道的大多数PROTACs都是基于与靶蛋白的非共价结合来起作用。且有报道显示，与靶蛋白不可逆共价结合的PROTACs未能诱导蛋白的有效降解。因此，在这项新研究中，科学家们评估了是否可逆共价PROTACs的潜力。

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为了比较不同的“弹头”（PROTACs分子中结合BTK的部分）如何影响靶蛋白降解，研究者们设计了3个不同的PROTACs分子：RC-1、RNC-1、IRC-1 ，分别与BTK可逆共价(RC)、可逆非共价(RNC)和不可逆共价(IRC)结合（上图a）。 3个PROTACs分子均使用了pomalidomide作为CRBN E3连接酶的结合剂（binder），且拥有相同的linker ，只有与BTK结合的部分不同。根据之前的研究进展，他们使用了急性髓系白血病细胞系MOLM-14作为模型系统。

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为了测试3种PROTACs是否能诱导BTK降解， Wang博士及其同事用RC-1、RNC-1和IRC-1对MOLM-14细胞进行24小时的处理，然后使用western blot来量化BTK的总水平(上图b) 。与之前的报道一致， IRC-1诱导了低效的BTK降解。对比RC-1和RNC-1 ，在较低浓度(8和40 nM)下， RC-1比RNC-1更有效地降解BTK ，在200 nM时，两者降解水平相当。作为迄今为止被报道最有效的BTK降解剂之一， RC-1可有效诱导MOLM-14细胞的BTK降解(DC50= 6.6 nM ，上图c) 。此外，无论是RC-1弹头(BTK结合剂）还是pomalidomide ，又或是两者的联合处理，都不能导致BTK降解(上图d) ，这表明双功能PROTACs分子对于促进三元复合物（BTK-PROTAC-CRBN）形成以诱导BTK降解至关重要。分页标题

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接着，研究者们还尝试了对可逆共价BTK PROTACs的linker进行优化(上图e) ，并发现，相比linker更长的RC-2、RC-3、RC-4和RC-5（分别比RC-1的linker长1个、2个、5个和8个原子）， linker最短的RC-1对BTK的降解最为有效。

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研究还分析了RC-1、IRC-1、RNC-1、RC-1-Me (RC-1非降解对照，仅一个甲基基团不同)以及它们相应的BTK结合剂对照RC-Ctrl、IRC-Ctrl（如ibrutinib）、RNC-Ctrl抑制MOLM-14细胞生长的能力。相关的化学结构和IC50值分别见上图和下表。有趣的发现是，虽然RC-1能降解细胞中的BTK ，而RC-1-Me不能降解细胞中的BTK ，但两种化合物具有相似的IC50值（0.31 vs 0.21μM），表明BTK抑制在对MOLM-14细胞产生毒性作用方面中发挥了作用。而IRC-1和RNC-1的IC50值分别为2.7μM和4.1μM 。 RC-Ctrl、IRC-Ctrl、RNC-Ctrl的IC50值也相似，在0.3至0.5μM范围内，表明这些“弹头”对细胞中BTK的抑制程度相似。

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进一步的分析显示， RC-1之所以比RNC-1和 IRC-1具有更强的药理学作用，诱导更有效的BTK降解以及细胞生长抑制，主要是通过其在细胞内较高的积累实现的。研究人员推断， RC-1的细胞内积累分别是IRC-1和RNC-1水平的10倍和16倍。而这种积累能力的增强与RC-1中的可逆共价结构部分有关。

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细胞中PROTACs的靶点结合能力（来源：Nature Communications）
虽然机制上来说， PROTACs是一种BTK降解剂，但由于它们含有能够结合和抑制BTK的“弹头” ，因此，本质上来看， RC-1是一个双功能的BTK抑制剂和降解剂。这代表了PROTACs一种新的作用机制。由于细胞内积累水平不佳，大多PROTACs靶点占有率低，而该研究揭示，在40和200?nM浓度下， RC-1分别可与50%和90%的靶点结合，这是它们能够同时发挥降解剂和抑制剂功能的基础。

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BTK-PROTAC-CRBN三元复合物的分子动力学模拟（来源：Nature Communications）
值得一提的是，研究还证实， RC-1对BTK的降解与其是否突变无关。更重要的是，研究还显示，这种改进PROTACs的可逆共价策略可能也适用于靶向其它分子（如FLT3），为增强PROTACs的疗效开辟了新的途径。研究者们希望，他们的这项工作在未来可被用于开发供临床使用的最佳PROTACs 。
参考资料：
1#Novel PROTAC enhances its intracellular accumulation and protein knockdown（来源：Baylor College of Medicine）
2#Wen-Hao Guo et al. Enhancing intracellular accumulation and target engagement of PROTACs with reversible covalent chemistry. Nature Communications(2020).