正文开始：

Western Blot 实验原理

WB 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot 分类

根据显色方法主要有以下几种：

现在常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行， 操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物 + 鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

实验常见的问题指南

01

参考书推荐

A. 对初学者看什么资料比较好？

解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。

02

针对样品的常见问题

此处内容较多，有部分答案省略，想查看更多详情，请点击【

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B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot（以下简写成 Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120 μg，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？

解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白

酶抑制剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂

来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？ 

解答：一般地 5* 106 就足够了。

D. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响? 

解答：能，没有问题，我们做过。

E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？

F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

03

抗体

T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗。

U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的 ELL + plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

04

滤纸、胶和膜的问题

X. NC 膜 / PVDF 膜 / 尼龙膜怎样鉴别？

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