【实验干货】最全流式细胞术实验操作步骤抗体滴度测定是流式细胞术实验设计中关

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抗体滴度测定

抗体滴度测定是流式细胞术实验设计中关键的第一步，确保标记过程中抗体浓度不会过高或过低。适当的抗体滴度能使实验者获得一个群体的抗原水平的量化信息，并能优化分离一个异源群体中表达特异抗原的细胞亚群。每一种新的抗体和预先滴定过的新批次的抗体都要进行抗体滴度测定。实验设计中确保抗体滴度测定在相同温度和相等时间内完成。

一般情况下，I06 个细胞需要 I00uL 含有 3ug 抗体的溶液，在此浓度下所有 IgG类抗体的非特异性结合都能被检测到，并且此浓度是一个较适当的滴度测定起点，抗体的使用浓度应足够使结合和未结合的抗体在合理的时间内达到平衡。在准确的移液技术范围内，染色反应的体积不是很关键。为减少实验成本，反应体积应尽量小，以便将抗体的用量减小

实验材料

表达抗原决定簇的靶细胞

不表达抗原决定簇的对照组细胞

特异性一抗

与特异性抗体浓度一致的同型对照

磷酸盐缓冲液（PBS) ，pH 7. 2 (在 4°C 平衡）

PBS+ 缓冲液含 [0.1 % (质量浓度）叠氮钠和 1 % ( 体积分数）胎牛血清或牛血清白蛋白（BSA) 或 200ug/m l 羊免疫球蛋白] 的 PBS，使用 0.2?2um 滤膜过滤，于 4°C平衡。加人叠氮钠是为了降低成帽现象，而血清或纯化的羊 Ig片段能提供未标记的和非特异性 IgG 来结合或阻断开放的 Fc受体。血清和BSA中过量的蛋白质能降低实验中可能发生的潜在的非特异性结合。

时间

：

60?90 min

特殊仪器

离心机

细胞计数装置（如库尔特计数器 Coulter counter)

微量移液器（移液体积精确到 10?200/x l 和 1000M1)

流式细胞仪

步骤

(11) 加入 0.5mlPBS，振荡混勻。

(12) 加人 0.5ml 甲醛固定液（2%，体积分数）。检测前于 4°c 避光保存样本（约5X105个细胞）。

(13) 每个样本使用流式细胞仪检测 5000个细胞。

上述方法是测定单克隆的荧光直接标记的一抗滴度。当使用非直接标记的多克隆抗体作为一抗时，一抗按其说明书的滴度使用，并需加人 6 倍使用浓度的荧光标记二抗 [此步稀释替代上述步骤 (3)]。按上述步骤完成(1)?(10)，其中步骤(6)中用PBS取代同型对照抗体。对照样本只加荧光标记的二抗。步骤(10)后，增加一步操作，

PBS

在每管细胞沉淀中加入 50ul PBS 和10ul 6 倍浓度的二抗, 再按上述步骤完成(8)?(13)。

结果

不管用于荧光标记的细胞来源如何，操作者都可以从激发光所显示的样本散射光中测量细胞，这些样本散射光由位于两个方向的光源产生M。前向散射光从前方细胞流前方发出，测量细胞的体积相对值; 正交散射光（也称侧向散射光或90。散射光）在光源的正交叉或90°方向测量，能提供细胞内结构和颗粒的信息。

图 13. 3中的双参数直方图:c 轴表示的是 90°散射光密度，3；轴表示的是前向散射光密度，z 轴表示的是细胞数量，此点密度直方图通过点密度的不同来表示细胞数量的差异。这些数据可用于系统进一步确定荧光数据输出。图 13. 3 表示存在几个不同散射特点的细胞群，图中圈起来的细胞是淋巴细胞的门（甲醛固定细胞能移动光散射信号。死细胞在前向散射光中降低而在 90°散射光中增高，从而能与活细胞区分开来）。这种设门方法所限定的细胞是图 13. 4 中用于荧光分析的细胞。

大多数流式细胞术数据以条列式数据格式储存了每一个激发事件（通常产生于每一个细胞）的每一个测量参数。这样，在流式细胞仪分析细胞后的很长时间内，研究者都能够重新显亦储存数据，用脱机分析窗口设门将多种参数合并，制成单和双参数直方图。仪器制造商会提供分析软件，一些免费的分析软件包也可得到（如WinMDI 分析软件可从网站

http://facs.scripps.edu/software.htm

l 下载，使用 WinMDI 可将数据转化为直方图）。

图 13. 4的实验数据表示在混合淋巴细胞中滴定荧光素标记的CD4特异性抗体。直方图中冋型抗体对照和未染色细胞所得数据用于设门以确定阳性和阴性细胞，这样99%的阴性细胞会落在阴性门中，而< 1%的细胞会落在阳性门中。图 13.4所分析的只是图13.3 散射图中所圈起来淋巴细胞。

为了确定信噪比，分析软件能确定阴性染色（噪）和阳性染色（信）的6个抗体滴度染色样本直方图中的荧光强度。用阳性细胞的荧光强度均值除以阴性细胞的荧光强度均值来计算信噪比，将所得值绘制成抗体稀释效率图（图13.5)。最佳滴度是产生最高信噪比的滴度，因为它能使阳性细胞和阴性细胞的染色效果差别最大，而与荧光强度的绝对值无关。

直接标记法

当使用多种荧光抗体标记细胞时，直接标记的荧光抗体可以同时加入，而不必按顺序加人。下面的实验实例显示的是用三种荧光抗体同时标记 T 淋巴细胞亚群，这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行使用浓度滴定。

实验材料

白细胞悬液（确定的细胞数量并经梯度纯化过）

anti-CD3 藻红蛋白（

）

anti-CD8 荧光素（

FITC

）

anti-CD4 CyChrome(Cy5)

与特异性抗体蛋白浓度一致的 PE 、FITC 、Cy5 标记的同型对照

PBS，pH 7.2,4°C平衡

洗涤缓冲液（PBS+0. 1 % 叠氮钠 + 1 % 胎牛血清或BSA) ，0. 22^m 滤膜过滤，4°C平衡

甲酵 [Polysciences，Warrington，PA ;cat.No.18814, 不含甲醇，16(质量分数）]

时间

：60?90min。

特殊仪器

离心机

细胞计数装置

微量移液器（移液体积精确到 10?200W 和 I000mI)

流式细胞仪

步骤

(1) 收获或分离细胞，用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液，调整细胞浓度至 5X105细胞/ml。

(2) 在每个 12mmX 75mm 管加人 Iml 细胞悬液以用于以下染色：每种抗体（一抗和同型对照）的单染；三种抗体的同时染色；一管不加抗体的阴性对照。

(3) 1500g离心 3min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液体 (约 I00ul)。

(4) 按预先滴定量在每管中加人荧光标记的抗体或对照血清或同型对照。

(5) 振汤混勾，冰上避光放置15min。

(6) 加人Iml冰冷的PBS。振荡混匀。

(7) 1500g离心3min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。

(8) 加入0.5ml PBS并振荡混匀。

(9) 加人0.5ml甲醛固定液（2% ，体积分数）。避光保存于 4° C 直到实验分析结束。

(10) 流式细胞仪每个样本检测 10000个门内细胞。

结果

图 13. 6 中流式细胞数据以双参数直方图的形式表示，1 轴和 3；轴分别表示两个不同的激发光，2；轴表示细胞数量，用量化的点密度来描述。每个样本通 Sfitc对照PE、 PE对照CyChrome和FITC对照CyChrome来分析。单色标记的样本用来确定荧光存在于预期细胞群，并能调整存在于其他色轴此颜色信号的电子补偿。同型对照或未标记样本

直方图中的资料能用来获得阴性和阳性分析门，这样99%的阴性细胞落在阴性门中，<1% 的细胞落在阳性门中。注意与 x 轴和3；轴交叉的两条线，它们划分出了落在每个象限的细胞数量。最下面的三幅图显示了只表达三种抗原表位中的一种的细胞（左上象限或右下象限）和表达其中两种抗原表位的细胞（右上象限）

间接标记法

下面的实验实例显示的是用两种得到荧光抗体间接标记T淋巴细胞亚群，这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行滴定。一抗都是鼠单克隆抗体，每种抗体同种型不同，从而能够选择标记有不同荧光染料的大鼠抗小鼠同种型的二抗进行标记。此方法可使用未标记的同种型抗体作为阴性对照。间接标记法可用于特定动物多克隆抗血清的染色。例如，羊源的特异性一抗可以用荧光染料1标记的抗羊的二抗进行染色，而兔源的特异性一抗可以用荧光染料 2 标记的抗兔二抗进行染色。

可以想象，用这种方法多色标记细胞时，每加入额外的或不同种属特异性一抗时，实验都会变得更复杂。另外还要考虑抗某种属特异性的多克隆抗体要通过其他物种抗体的吸附，以排除因抗体交叉反应而非特异地标记其他动物来源抗体的机会。

实验材料

此部分列出的抗体都能从 Southern Biotech(Birmingham，AL) 公司获得。每种抗体都有推荐的工作液浓度。标记的二抗使用浓度一般为 lug/106 细胞。淋巴细胞悬液（细胞计数，经梯度离心纯化）

anti-CD3 IgGl鼠单克隆抗体

anti-CD8 IgG2a鼠单克隆抗体

鼠 IgGl 和 IgG2a同型抗体

PE标记的兔抗鼠 IgGl亲和纯化抗体

FITC标记的兔抗鼠 IgG2a亲和纯化抗体

PBS，pH7.2,4℃平衡

漂洗缓冲液（PBS + 0. 叠氮钠 + 1 % 胎牛血清或BSA) ,0.22um滤膜过滤，4°C平衡

甲醛 [Polysciences，Warrington，P A ;cat.No.18814, 不含甲醇，16 % (质量分数）

时间

：

90? 120min

特殊设备

离心机

细胞计数设备

微量移液器 (移液体积精确到 1 〇 ?200ul和 IOOOuI)

流式细胞仪

步骤

(1) 收获或分离细胞，用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液，调整细胞浓度至 5 X 105细胞/ml。

(2) 在为每种抗体（未标记的一抗和同型对照）准备的12mm X75mm管中加人Iml细胞悬液，另备两只管，分别装所有抗体和只加二抗对照。

(3)1500 g 离心3min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀可以残留少量液体（约I00ul)。

(4) 加人预先滴定过的适量抗体 (一抗或同型对照）。

(5) 混句，冰上避光放置15min。

(6) 加人Iml冰冷的清洗缓冲液。震荡混匀。

(7) 1500g?离心3min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液体（约I00uI)。

(8) 按厂家推荐的使用浓度在每管加入二抗。

(9) 振荡混勾，冰上避光放置15min。

(10) 加入Iml PBS。振荡混匀。

(11) 1500g离心3min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。

(12) 加人0.5ml PBS并振荡混勻。

(13) 加人0.5ml甲醛固定液（2 % ，体积分数）。实验分析结束前将样本避光保存于 4℃

(14) 用流式细胞仪分析每个样本，检测10000个门内细胞。

结果

预期结果应与图 13. 6 中HTC与PE组合图形相似，其更大的优点在于信噪比较好，阴性细胞落于更左下的象限，阳性细胞位于其他三个象限。这是由于多个荧光标记的二抗能与结合同一未标记的一抗，从而具有潜在的信号放大效应。实验结果分析与前相同

胞内标记法

胞内蛋白的检测可以包括细胞分泌产物（如细胞因子）、组成结构（如微管蛋白）或细胞内整合产物 (BrdU或病毒蛋白等）。就分泌产物而言，可以是某些形式的细胞激活研光。在这类实验中，可以使用蛋白质分泌阻断剂（如monensin 或 brefeldinA ，均可从Sigma Aldrich 获得）使蛋白质不能分泌而在高尔基体中聚积，这有助于在设立实验时对抗体使用浓度的滴定以及证明抗体是否与正确的抗原结合。 monensin处理过的细胞应未处理过的细胞荧光强度高 [6]。此外，为了保证荧光标记的染色是胞内蛋白（而不是膜上蛋白），在细胞被固定前可用未标记荧光的抗体与之预先孵育以封闭细胞表面抗原。

对胞内染色的细胞首先要对细胞进行固定，并使细胞膜通透性增加。对固定的细胞增加膜通透性才能使标记抗体进入细胞与胞内蛋白结合。常用的固定剂是PBS溶解的多聚甲醛（paraformaldehyd) 溶液，它能使蛋白质发生交联，但是这种固定方法可能会限制抗体识别抗原。固定剂的浓度范围为0.2 5 % ?4% ( w /V )。其他组织固定剂（如甲醇等）可能会使抗原结构改变从而影响抗体的染色，因为有些抗体识别的是抗原的构象表位。就增加细胞膜通透性的方法，含 0.1% 皂素(saponin) 的平衡盐溶液就足以使抗体进入细胞。也可使用其他细胞膜渗透剂（如 0 .02% 的Tween 20 ) 。由于这种细胞膜通透作用可以消失，有必要在所有溶液中加人皂素 (包括染色和洗涤过程）。

使用荧光直接标记的单克隆抗体（与多克隆抗体的间接标记相比）能使抗体的非特异性结合的可能性减至最小，这也使研究者有可能使用同型对照从而进一步验证抗体结合的特异性。为了使样本保存的时间比隔夜保存更长，在细胞内染色完成后可将样本重悬于甲醛溶液中。

实验材料

甲醛 [Polysciences，Warrington，P A ;cat.No.18814 , 不含甲醇，16 ( w /v ) ，用 PBS1 : 4 稀释，终浓度为 4 % ( w/V)

PBS (PH 7. 2)

皂素缓冲液，0.1%(W V ) 皂素溶于含 0.0 5% ( w /V ) NaN3的Hank s’平衡盐溶液。室温保存1个月稳定

Alexa488标记的抗胞内抗原的单克隆抗体

标记的同型对照抗体

时间：

90 ? 120 mm。

特殊设备

离心机

细胞计数设备

微量移液器（移液体积精确到 10?200ul 和 l000ul)

流式细胞仪

实验步骤

在一些实验方案中，研究者可能希望同时标记胞内和胞外抗原。在这种情况下，首先标记胞外抗原，然后进行如下实验步骤（固定、增加膜通透性、胞内标记）。

(1) 1500g?离心 3m in 收获 5 X 105 个细胞，吸管吸弃上清。加人 iml PBS，振荡混匀重悬细胞，获得单细胞悬液。

(2) 加入Im l 冰上预冷的4%甲醛固定液，室温孵育10min (每隔几分钟振荡混匀细胞，确保细胞为单细胞悬液）。

(3) 1500g?离心3min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀。 1ml PBS 重悬细胞沉淀。

(4) 1500 g?离心3min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀块。 Iml 皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(5) 1500g离心3min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀。

(6) 100^1 皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(7) 加人适量抗体（一抗或同种型）

(8) 轻轻混匀试管，室温避光孵育 30 min。

(9) 重复步骤 (4) 和（5)。

(10) 加入Iml PBS，轻轻混匀，1500g离心3 min。

(11) 加入0 ?5 ml PBS，轻轻混匀。

(12) 流式细胞仪每个样本获得10000个门内细胞。

结果

图 13. 7 显示的是一个胞内染色流式细胞仪分析数据实例，其中x轴表示Alexa 488焚光强度，^ 轴表示细胞数量，A 图为阴性对照，B 图为阳性标记的胞内抗原。直方图中显示的是用软件分析的一群相同细胞中阳性（信）细胞和阴性（噪）细胞的荧光强度均值。在标准化的流式细胞仪上（如本章中序言，仪器显示和质量控制中所述），仪器操作者应每天用已知 MESF 值的多个荧光强度的微珠校准仪器。这种情况下，微珠数应该与荧光染料分子数量一致。这样直方图所绘出的MESF的相对值与仪器显示的荧光强度一致，呈线性关系。如果研究者想要定量测量荧光MESF值，首先要告诉操作者，在样本上机前，应将仪器设定在分析多种微珠荧光强度的设置，从而能得到样本的不同荧光强度。这类实验可能对研究者希望比较抗原表达水平有用（细胞内的和细胞外的），如不同时间的、动物与动物之间的治疗前后的抗原表达

来源：抗体制备与使用实验指南

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