实验小白助攻手册│MTT比色法竟如此简单 MTT比色法作为常用于测定细胞活性与增

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MTT比色法作为常用于测定细胞活性与增殖的方法，几乎是与细胞相关的研究所需要进行的基本实验，因为该方法可以定量测定细胞培养的情况，对于最适培养环境的敲定，或者是研究某种物质或者遗传改造对细胞活性的影响都不在话下。

老规矩：原理先行

MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在500-600 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。一般，溶液越黑表示活的、代谢正常的细胞数量越多。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

我也有缺点

由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT比色法的敏感性低于荧光和冷光试验。特别是对于那些不容易增殖或者代谢活性低的细胞而言。另外，某些化合物可能会干扰MTT形成甲瓒，影响结果，比如多酚、维他命A、辅酶A和DTT。另外，无论是MTT还是甲瓒都是细胞毒性的，要注意做好防护措施。

一些关于试剂的重要知识

MTT: 光敏，应该使用锡箔纸避光保存。并且避免污染，黄色代表正常，如果变绿或者蓝色，可以判断为细菌或者细胞污染，或者是接触了光照。4度保存的话，MTT保存液最多可以保存18个月。MTT有毒性，使用时要做好保护措施，可能刺激皮肤和眼睛。一定要无菌。MTT对均很敏感。细菌也会导致MTT比色OD值升高。

MTT工作液通常为5mg/ml。即称取MTT0.5g，溶于100ml的PBS（PH=7.4）或者无酚红的培养基中，用0.22 um滤膜过滤除菌，4度保存即可。期间避光。工作液一般能够保存两周。操作时最好在超净台，并且避光操作。

甲瓒的溶解：可以用DMSO（分析纯。可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但是毒性大，并且需要除去培养基，可能会带走结晶，影响实验结果。）、酸化异丙醇、SDS，或者三联溶解液（即是分别称取异丁醇5ml、SDS 10g和10 M HCL 0.1 ml用ddH2O配置成为100 ml的溶液，三联法不需要除去原培养基，但是溶解能力不如DMSO。另外SDS在低温下会结晶，使用前需要放置室温溶解待用）。建议使用sigma的DMSO。

PBS: NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g调pH7.4，定容1L。灭菌分装。

我是正式的Protocol

接种细胞

用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞（细胞浓度的问题见后面的注意事项）接种到96孔板，每孔体积200ul。96孔板四周的32个孔不要使用，建议加入200ul灭菌PBS补齐。

培养细胞

CO2培养箱，5% CO2浓度，37度培养24-48h。（可根据试验目的和要求决定培养时间）。注意，时间太长，营养不够，可能影响结果，建议72h后换液。

加药

可以使用不同药物也可以用同一药物不同梯度，具体根据你的试验目的决定。但是每一组都要求为三个，即空白组（不加细胞其他一样）、对照组（不加药，但是加药物溶剂）和实验组。如果不加药的MTT试验请忽略此步骤。

呈色

每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4) 20u后继续孵育4 h，终止培养（可通过显微镜观察，若是细胞内的紫色结晶很明显了即可），小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

溶解

每孔加150 ul DMSO（这以DMSO为例），振荡10min，使结晶物充分融解。

比色

选择570 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。可以将630 nm作为参比波长，OD570-OD630为每孔最终值。

结果怎么读？

存活细胞比例=（实验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）×100

仙人指路

MTT法只能用于检测相对活力，因此需要保证实验结果的线性，因此需要保证MTT的吸光度最好在0-0.7范围之内，对照组在0.7-1.2范围。如果吸光度过低，可以试着增加接种细胞数量和培养时间，并确保你的细胞培养环境是合适的。但是，如果放太多细胞会得到非常高的吸光度度数，同时也很容易被细菌或者酵母污染。

你可以通过梯度稀释（从106-103细胞/ml）来确定哪个浓度会得到最适宜的吸光度。

安必奇生物喵综合整理

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