改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？( 五 )

Cas9酶究竟如何在RNA的指导下切割DNA？
这些结果令我倍感振奋，但与此同时，这也引出了一系列亟待解决的问题。为了理解Cas9酶究竟如何在RNA的指导下切割DNA ，我们需要精确定位Cas9蛋白质中执行切割功能的区域。为了证明DNA切割的专一性，以及切割依赖于向导RNA与DNA序列的匹配，我们需要逐个碱基地改变DNA序列，并表明当RNA-DNA匹配不够完美的时候，切割就无法进行。要表明向导RNA和tracrRNA是如何工作的，我们需要对这两种分子进行系统的缺失突变，找出真正必需的RNA片段。
为了回答这些问题，马丁和克日什托夫进行了辛苦的工作，但很快，一个清晰的画面逐渐浮现出来。他们发现， Cas9蛋白质会锚定在DNA双螺旋上，撬开DNA双链，使CRISPR的RNA分子与DNA的一条链形成新的双螺旋，然后， Cas9蛋白质使用两个核酸切割模块把DNA的双链同时切开，制造出双链断裂。
事实上， Cas9可以锁定并切割任何与向导RNA配对的DNA序列。打个比方，向导RNA的功能就像GPS可以指导Cas9精确定位到目标区域，即向导RNA和DNA配对的位置。 Cas9是一个真正可以操作的核酸酶，我们可以定制设计该RNA分子，使它靶向锁定任何DNA序列。有了包含20个碱基的向导RNA ， Cas9可以找到任何与其配对的DNA ，并进行切割。
考虑到细菌与病毒在演化过程中鏖战不休， Cas9的功能不难理解。配备了从CRISPR序列中转录出的RNA分子， Cas9可以在噬菌体基因组中轻易地找到与之对应的DNA区域。这是细菌的巡航导弹?针对病毒的DNA精确快速地实施打击。
有了马丁和克日什托夫的实验结果，我们就可以着手解决下一个问题了：如果细菌可以用Cas9蛋白质来切割特定的病毒DNA序列，那么，我们是否可以用Cas9切割其他DNA序列，而不局限于噬菌体？
马丁和我清楚基因编辑领域的进展以及它的潜力，我们也知道锌指核酸酶和TALEN的核酸酶的致命缺点。我们不无惊叹地意识到，我们已经误打误撞发现了一个新系统，它有望超越现有的基因编辑技术。要把这个微小的分子机器变成强大的基因编辑工具，我们还需要更进一步的实验。
目前为止，我们把一个复杂的免疫系统还原成了几个可以分离、修饰并重新组合起来的元件。此外，通过精细的生化试验，我们理解了这些元件的功能，并推断出了其分子机理。下一步，我们要做的是，确认可以改装Cas9和向导RNA分子来靶向锁定并切割任何DNA序列。这个实验会真正展示出CRISPR的全部威力。这一步?改造CRISPR-Cas9分子机器?事实上包括了两小步：产生一个想法，再用实验验证它。
首先是要有想法。马丁向来一丝不苟，为了鉴定每一个碱基对功能的影响，他系统地修饰了RNA分子?包括用于靶向锁定DNA的向导RNA分子，以及把它和Cas9结合在一起的tracrRNA分子。有了这些知识，马丁和我进行头脑风暴，考虑如何把这两种分子组合到一起。如果我们可以把一个分子的尾巴跟另一个的头部融合起来，制造出杂合的RNA ，如果可行，那会大大简化该分子机器，两条RNA分子?向导分子（CRISPRRNA）和协助分子（tracrRNA）?将合二为一。显然，如果CRISPR要用于基因编辑，简化的系统用途会更广。
基于这个想法，我们设计了实验。我们需要测试这个融合的RNA分子，并鉴定它是否依然可以指导Cas9切割对应的DNA序列。此外，我们的实验还可以回答Cas9蛋白质是否真的可以切割任何DNA序列，而不只是针对噬菌体的基因片段。这时，我们意识到了这是一个重大突破，为了尽快完成实验，我们并不想浪费时间寻找那些实验室没有的基因。
于是，出于方便，而不是偏好，我们决定使用一个来自水母的编码绿色荧光蛋白质的基因，即GFP（GFP广泛应用于世界各地的实验室，用于示踪细胞及其蛋白质成分）。马丁在GFP基因里选取了长度为20个碱基的5段区域，并针对性地设计了5种配对的RNA分子。准备好了新的单链RNA分子之后，我们就把它们与Cas9蛋白质以及GFP基因放在同样的DNA切割反应?现在，这个酶促反应已经成了常规实验。