改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？( 四 )

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Cas9使用两个RNA分子切割DNA 。
迈克在我们实验室的工作马上就要结束了?他马上要返回德国，完成博士论文，而且已经订好了机票，但是，迈克和马丁下决心测试纯化的Cas9酶是否可以切割DNA 。他们参照埃马纽埃尔在化脓链球菌中的工作，合成出了CRISPR的RNA分子。然后，他们把这些RNA分子与Cas9蛋白质和一些DNA样品混合起来。重要的是，这些DNA样品中有一段序列跟这些RNA配对。
像大多数科学探索一样，这次实验以失败告终。在接触Cas9蛋白质和配对的向导RNA前后， DNA没有任何变化。要么迈克的实验设计不合适，要么Cas9的确没有切割DNA的功能。迈克在实验室组会展示了他的结果，悻悻地返回德国了。这个夏天辛勤的分离、纯化、研究Cas9的工作似乎是竹篮打水一场空。
在我们跟埃马纽埃尔、克日什托夫的合作进展过程中，马丁开始跟迈克密切合作，并指导他的实验，但马丁也开始寻找教职。面试的时候，他的足迹也遍及世界各地，包括瑞士，他最终接受了苏黎世大学的工作邀请。不过，对我们来说，幸运的是，在迈克离开的时候，马丁的日程安排稍微不那么紧张了，因此他可以从迈克遗留的问题入手，接手这个课题。他把注意力转向了Cas9 ，打算解决这个遗留问题：Cas9的功能到底是什么？
迈克和马丁的工作似乎表明了Cas9不能切割DNA ，但是，实验本身是否可能有问题呢？这有许多可能，从最无趣的（比如，试管里的蛋白质降解了）到有趣的（比如，我们缺少了该反应必需的一个成分）。为了探索后一种可能，马丁和克日什托夫开始尝试不同的办法来设计检测DNA切割的实验。真是无巧不成书，他们很快发现，他俩长大的地方非常接近?克日什托夫在波兰境内，而马丁在当时的捷克斯洛伐克境内，他们都说波兰语，这极大地方便了他们通过Skype交流，商讨实验。
最终，克日什托夫和马丁进行的实验表明，除了向导RNA ，他们还需要第二种RNA ，叫作tracrRNA ，埃马纽埃尔实验室发现，在化脓链球菌中， tracrRNA对于向导RNA合成是必需的。结果很简单，但我们却非常兴奋：与向导RNA分子里20个碱基完全匹配的DNA被干净地切开了。对照实验表明，这种匹配对于切割是必需的，如同Cas9蛋白质和tracrRNA同样是必需的。
本质上，这些结果以最少的成分模拟了CRISPR免疫反应在细胞内的进程?Cas9和两个RNA分子代表了细胞内的分子，而DNA分子代表了噬菌体的基因组。最重要的是，基因组里有20个DNA碱基与向导RNA分子配对，这意味着，向导RNA与DNA的一条链可以通过碱基配对形成双螺旋。这样的DNA-RNA双螺旋可能是Cas9特异性切割DNA的关键之处。
我们无法直接看到DNA被切割，所以需要一种灵敏的检测方法监控试管内的DNA切割反应。一段含有50个碱基对的DNA双螺旋长约17纳米，大致相当于最细的头发丝直径的千分之一。即使是用最强大的显微镜也无法看到它，因此，马丁和克日什托夫采用了核酸研究人员最爱的两种工具：放射性同位素磷和凝胶电泳分析。放射性磷原子可以通过化学反应与DNA分子结合，使DNA在感光胶片上显影，由于DNA带有负电，它在电场中会向正极运动，凝胶中的空隙则起到了筛子的作用，使得DNA可以根据大小在凝胶电泳中得到区分。
如果DNA被Cas9蛋白质切开，那么我们就可以看到两条带，否则就只有一条带。马丁进一步表明， Cas9蛋白质在向导RNA与DNA匹配的位置把DNA的双链都切开了。重要的是，向导RNA和tracrRNA分子在切割完DNA之后并未发生变化，因此可以被Cas9重复使用。看到这些结果，我们意识到，我们澄清了这个DNA切割机器的几个关键环节，包括化脓链球菌和嗜热链球菌（以及其他含有类似CRISPR系统的细菌）中靶向识别噬菌体序列，进而摧毁噬菌体DNA的分子机制。 DNA切割的三个关键成分是Cas9酶、向导RNA和tracrRNA 。