影客网络科技分子构建不会做？看这篇就够了( 二 ) 做过分子实验的人都知道

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4.酶切
强烈推荐NEB的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK ，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4 。另外TAKARA的酶也还可以。

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【影客网络科技分子构建不会做？看这篇就够了】5.连接
最常用的是NEB的T4连接酶，很好用，但是注意Buffer里有ATP ，反复冻融ATP失活很快，拿到buffer后就分装， 10uL/管，一次性使用。
载体总量：一般来说，载体浓度在20-100ng/uL较好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从50-100ng就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用10-15uL 。
载体和插入片段比例：载体和插入片段比例一般是1:7 ，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高片段浓度，同时加大比例1:10 。

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6.转化
按照SOP做就行，话说实验室原来从takara买感受态（competentcell），后来发现还是自己做的效率高（protocol免费索取）。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个技术员，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了kana的LB ，直接晕过去了。

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7.鉴定
想要快速鉴定，建议用菌液PCR ，菌液PCR是有一定讲究的，很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多，为什么？因为你PCR引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准， PCR方法鉴定是极其准确的，数百次菌液PCR经验。 PCR鉴定做起来也很简单，拿个2mLtube ，装0.5mL加入相应抗生素的LB ，摇个三小时左后取1uL做模板就行了。如果想更快，直接菌落PCR也不错，效果一样。

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8.测序
拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；
还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。

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