影客网络科技分子构建不会做？看这篇就够了做过分子实验的人都知道

做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很苦逼的， 1个月做100个克隆那都是小case ，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较极品的稀有基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面就和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人：
1.准备工作
俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推荐两个工具，一个是oligo软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是DNAstar软件，工具极强大，一款全面的生物医学软件，用作DNA和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。

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插播个笑话：听说隔壁实验室里有个学医的学生来做课题，很聪明很刻苦，但除了他以外，包括老板在内都是生物物理背景，整个实验室对分子生物就只有一个粗浅的概念，这个学生就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这学生他不懂啊（要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂），自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR ， P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个突变，要懂的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测这下这段就行。他呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，他光测序就要花好几千（你得佩服她老板真有钱呀）。这件事教育我们准备工作是多么重要。
2.设计引物
1)注重要：看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。
想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1质粒，注意阅读框，要是移码了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3 ，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！
其他需要注意：

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设计酶切位点时要加保护碱基（大家要用T载体就当我没说）;酶切位点设计原则：尽量用粘性末端，实在不行就用一些常用平端酶，如EcoRV和SnaB1等，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM值的时候要减去这些不匹配的序列；注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。擅用GeneOverlap ，比方说加个flag标签， his标签， my标签之类的，直接设计三引物overlap一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候GeneOverlap就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1 ， Nhe1和spe1 ， Xho1和Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧。3.PCR扩增
如果没有现成的质粒可供酶切， PCR是最理想也是最方便的策略。目前市面上可选择的PCR酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的taq酶都能满足需求。但如果遇到难PCR的高GC基因，可以换不同PCR酶，添加一些DMSO ，甘油等，实在不行可以考虑Clontech的2GCrichkit ，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化PCR产物，去除一些非特异性条带。

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