克里米亚-刚果出血热病毒幸存者体内分离出人源保护性中和抗体( 二 )

接下来，作者通过比较全部抗体与7个靶向Gc不同表位的Fab片段的竞争实验，确认大部分抗体均靶向六种表位中的一种。为确认抗体靶向的具体表位序列，作者对上述已进行表位分类的抗体进行表位定位实验：使用表面表达有Gc突变体的酵母文库，进行三轮荧光激活的流式分选，通过对Gc突变体的测序，最终确定了6组表位的具体序列信息，并将这些表位信息，在Gc结构模拟图上进行了定位（图1）。

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图1 抗体的六组表位序列及其在Gc结构模型上的定位

为确定筛选出的单抗的中和效果，作者构建了包含全部结构蛋白及Nano-Glo荧光素酶报告基因的病毒样颗粒tecVLP ，可以模拟真实病毒的入侵，用于对小分子和单抗的评估。以恒定的抗体浓度（35 nM），检测全部抗体对分支IV阿曼毒株tecVLP的中和效果，发现靶向Gc融合肽和结构域II的抗体显示最强的中和活性，而全部GP38特异性单抗均不具备中和活性。作者还进一步测试了活性较强抗体的广谱中和能力，确定三株抗体ADI-37801 （表位1 ，靶向融合肽）、ADI-36121 （表位3 ，靶向结构域 II）和ADI-36145 （表位6 ，靶向结构域III）用于后续实验（图2）。

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图2 高效抗体的中和效果汇总
针对此前应用单株抗体进行治疗时易导致毒株产生逃逸突变的问题，作者在进行抗体的动物实验前，先测试了三株候选抗体作为协同抗体对的组合可能。通过将非竞争表位的抗体进行等摩尔比混合，测试了它们对阿曼及另外几种毒株来源的tecVLP的中和效果，发现ADI-37801可以与另两株抗体协同。于是，作者测试了三种抗体及两种抗体组合，在50mg/kg用量下单次注射对小鼠的攻毒预防及保护效果，结果显示全部抗体及组合在提前24小时注射时，均可以有效保护，但在攻毒后使用时则未能有效保护小鼠。为获得保护性效果，作者对三种抗体的可变区进行组合构建出4株双特异性抗体，经异源表达和纯化，分别测试了这些双特异抗体对不同tecVLP的中和效果，发现攻毒24小时后一次注射DVD-121-801即可有效保护小鼠；结果还显示，双特异抗体的构建方式影响其保护效果，两组抗体V区位置交换的DVD-145-801则不具备保护效果（图3）。

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图3 双特异抗体构建策略及动物实验结果
在本项研究中，作者首次在康复病人体内分离获得数百株人源CCHFV单克隆抗体，这些抗体大多靶向Gc上的6个保守表位，部分抗体具备较强的中和活性和预防效果，通过抗体改造还获得一株具备治疗效果的双特异抗体，有望用于后续临床开发。当然，本文也存在一些问题，如近400株抗体无一靶向Gn的原因尚无定论，高效中和抗体的确切作用机制还有待结构生物学研究，本研究发现的抗体在非人灵长类及人体中的效果仍需确认。但这种从康复患者血浆中直接分离单个B细胞并通过体外实验快速鉴定候选中和抗体的策略，可推广至其他尚无有效治疗手段的病毒防控中。