金岱基因|能说说测序仪的测序技术和原理是什么吗？( 二 ) 随着人们对自身基因遗传信息的了解和掌

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第三代：单分子/纳米孔测序
测序技术在近两年中又有新的里程碑， Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、PacificBiosciences公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，其中， Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。
由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，第三代测序技术通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的，三代测序设备在DNA序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，未来随着技术的改善，三代测序设备将更为稳定和成熟。

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第三代测序优势：
1）第三代基因测序读长较长，如PacificBiosciences公司的PACBIORSII的平均读长达到10kb ，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。
2）直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了PCR扩增带来的出错。
3）拓展了测序技术的应用领域，二代测序技术大部分应用基于DNA ，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列， RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板， DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
4）三代测序在ctDNA ，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测；在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。
第三代测序缺陷：
【金岱基因|能说说测序仪的测序技术和原理是什么吗？】1）总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因；第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40% ，极大地高于二代测序技术NGS的错误率（低于1%）。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。
2）三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。
3）成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。
4）生信分析软件也不够丰富。
三代测序和二代测序相比较，第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，三代读长超长，准确低，费用高，但因读长长，利于组装和发现uniquereads潜在优势明显，但是劣势也限制了三代测序的商业应用。
未来前景
目前，第二代的基因测序技术高通量测序（NGS）是市场商用主流。第三代的单分子/纳米孔测序将是未来的大势所趋，但是预计在将来5-10年内二、三代基因测序会共存，但二代测序仍将是测序市场商业应用主流。