基因编辑技术发展及其在家畜上的应用( 五 ) _小知识

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其他方面的应用
用猪的器官进行人的异体器官移植在克服人体器官严重不足方面具有巨大的应用潜能。临床上，在猪体内几乎所有组织存在 α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase, GGTA1)基因所编码的 α-1,3-半乳糖抗原(α-1,3-galactose,α-gal)，此抗原是引起人与猪异种器官移植的超急性排斥反应 (hyperacute rejection, HAR)的主要因素。Hauschild 和 Niemann (2011)利用 ZFN 技术以及体细胞核移植技术首次实现了在猪体内 GGTA1 基因的双等位基因敲除，从而为猪-人的异种器官移植的实现迈出了可喜的一步。除了 Gal 之外，单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetyl- neuraminic acid hydroxylase, CMAH)基因编码的 N- 羟乙酰神经氨酸 (N - g1yco1ylneuraminicacid, Neu5Gc)是另一种主要免疫抗原，Neu5Gc 可在 GG? TA1基因敲除猪体内广泛表达(Song et al., 2010) 。Lutz等(2013)同样应用ZFN技术和体细胞核移植技术生产出具有 GGTA1/CMAH 双基因敲除的猪，并在体外证明了人体血清对 GGTA1/CMAH 双基因敲除猪的免疫排斥反应相对单基因 GGTA1 敲除猪来说更小。Martens 等(2017)利用 CRISPR/Cas9 技术生产出了同时敲除GGTA1、CMAH以及B4GALNT2 3个基因的猪，人类血清对该猪异种免疫排斥反应显著降低。这些特异性抗原敲除猪模型的建立，将为最终培育出适用于临床应用的猪器官奠定了基础。
在新型环保节粮猪的培育过程中，华南农业大学吴珍芳团队将四个来自微生物的酶类基因bg17A、eg1314、xynB以及eappA插入到猪的基因组，培育出的转基因猪新育种材料，饲养过程中氮磷排出显著减少，同时节约精粮食，生长速度快，育肥出栏快，有望缓解养猪业的环境污染和粮食消耗问题(Zhang et al., 2018) 。
四、前景与展望
以ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 为代表的新型基因编辑技术，已成为非常有价值的分子生物学工具。这三种基因编辑技术大大增强了研究和探索各种模式生物包括家畜动物的能力。研究人员借助这些分子工具，能够开发以家畜为代表的生物医学疾病模型(Yan et al., 2018)，且在家畜的抗病育种(Gao et al., 2017)、性状改良(Wang et al., 2017)、乳腺生物反应器(Ma et al., 2017)等方面具有重要的应用。
相对于 ZFN 和 TALEN 技术，CRISPR/Cas 系统以其更高的打靶效率和更低的成本，显示出广泛的应用前景和灵活性。目前，制约 CRISPR/Cas 系统发展的主要因素是脱靶效应及 PAM 序列的制约。科学工作者进行了很多研究来克服这些问题。在降低脱靶效应方面，有研究发现增加或减少 2~3 个核苷酸的 sgRNA 能够减少错配率从而增加靶序列的专一性(Fu et al., 2014; Kim et al., 2015) 。Doench等(2016)创造了新的 sgRNA 设计规则并建立了人类和小鼠的全基因库，用基因库设计的sgRNA 能够有效减少 CRISPR / Cas9 系统的脱靶效应。Frock 等 (2015)将 Cas9 核酸酶改造为 Cas9 切口酶(Cas9 nick- ase, nCas9)，nCas9 能够使 Cas9 蛋白的 HNH 或 Ru- vC 结构域失活而形成单链断裂(single-strand breaks, SSBs)以减少脱靶效应。Qi 等(2013)把 Cas9 蛋白改造为Dead Cas9(dCas9)，dCas9能够使HNH 和RuvC两个活性位点均失活，sgRNA介导dCas9 与靶序列结合可以抑制基因的起始转录从而降低脱靶脱靶效应。在克服 PAM 序列的依赖性方面，有研究发现不同来源的 Cas9 蛋白可以识别不同的 PAM 序列，比如SpCas9识别5'-NGG PAM，NmCas9识别 5'-NNNNGATTPAM (Hou et al., 2013)，StCas9识别 5′ -NNAGAAPAM (Cong et al., 2013)，KKHsaCas9 变体可以识别5'-NNGRRTPAM等(Kleinstiver et al., 2015) 。此外，2018年东京大学Osamu Nureki教授和麻省理工学院的张锋教授报道了一个SpCas9 变体SpCas9-NG，可以识别5'-NGPAM (Nishimasu etal., 2018) 。Cas9蛋白的多样性扩大了PAM区打靶目标范围，有助于选择更为合适的靶位点。
CRISPR/Cas 技术已经发展为一个强大的基因编辑工具，随着其新系统如 Cpf1、C2c2、BE 等的不断涌现，并呈现多元化发展，其已成为近几年进行基因组编辑优先选择的技术(葛陆星等, 2017) 。随着新型基因编辑技术的不断研发拓展与完善，以及三种技术的联合应用，在家畜育种、动物模型制作以及生物技术研究中必将得到广泛应用，推动畜牧业的整体发展。
作者：谢晓刚薛嘉康健葛陆星董翔宸王宇飞张涌权富生
单位：西北农林科技大学动物医学院/农业部动物生物技术重点实验室
来源：《农业生物技术学报》，2019, 27(1): 139~149
微信号：agrogene
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