基因编辑技术发展及其在家畜上的应用( 四 ) _小知识

不饱和脂肪酸 ω-3 有益于调整动物机体内部脂类代谢，ω-3 脂肪酸脱氢酶表达由 Fat-1 基因调控，使脂肪酸由 ω-6 形式转变为 ω-3 。张驹等通过 CRISPR/Cas9 技术成功敲除了山羊的 MSTN 基因，并且在该位点中定点插入了 Fat-1 基因，生产出体内既可以高表达 Fat-1 基因，提升羊肉中 ω-3 含量，又能增加羊肉产量的绒山羊新育种材料(张驹, 2016) 。角是牛、羊特有的组织结构，在养殖过程中，角容易损伤饲养人员，而人为去角又会违背动物福利且费时费力。Tan 等(2013)通过 TALEN 技术以无角安格斯牛 1 号染色体上重复 202 bp 为模板，得到了经基因编辑的荷斯坦牛胎儿成纤维阳性细胞。随后通过体细胞核移植技术成功获得了无角荷斯坦牛，加快了无角牛新品种的育种进程 (Carlson et al., 2016) 。由于猪体内缺乏功能性的 UCP1 (Uncoupling protein 1)基因，导致仔猪体温调节不良，易受寒冷的影响，2017 年中科院动物所赵建国和金万洙团队合作使用 CRISPR/Cas9 系统，将外源性小鼠 UCP1 基因定点插入到到猪内源性 UCP1 基因位点，生产出的后代猪提高了产热能力，降低了新生崽猪由于受冻而死亡的可能，使抗寒猪的育种迈出了坚实的一步(Zheng et al., 2017) 。
03
应用于家畜乳腺生物反应器研制
动物乳腺生物反应器(mammary gland bioreac- tor)亦称为转基因动物乳腺个体表达系统，是指利用哺乳动物乳腺特异性启动子调控原件指导目的基因在乳腺中特异性表达，以期从基因修饰动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器(付玉华等,2010)，在牛、羊等家畜动物中具有广泛的应用。
Moghaddassi 等(2014)年报道了利用 TALEN 技术结合体细胞核移植技术成功实现了人血清白蛋白(human serum albumin, hSA)基因在母牛乳腺中的高表达，为大规模的生产质量可靠、价格便宜的人源性的血清白蛋白奠定了坚实的基础。Peng 等 (2015)利用最新的 CRISPR/ Cas9 技术，将猪作为乳腺反应器动物生产出了乳腺中高表达人重组血清白蛋白的转基因猪。Cui 等(2015)利用 TALEN 技术以及体细胞核移植技术，将人乳铁蛋白基因(human lactoferrin, hLF)定点插入到奶山羊的 β-乳球蛋白(Beta lactoglobulin)基因座，实现了乳铁蛋白在奶山羊乳腺中高表达，不仅提高了羊奶的营养价值，而且靶向沉默了 β-乳球蛋白基因，减少了新生儿的乳蛋白过敏反应。
笔者所在实验室朱红梅(2016)同样借助 TALEN 这种基因编辑工具，利用同源重组手段将人乳白蛋白基因(human lactalbumin, hLA)定点插入到山羊 β-乳球蛋白基因位点。葛恒涛(2016)利用 TALE切口酶介导的基因打靶技术将口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和 PRRSV 等具有免疫原性的结构蛋白基因定点整合至山羊 β-乳球蛋白基因座，并通过体细胞核移植技术生产出了乳中可分泌抗病活性蛋白的转基因乳腺反应器奶山羊。此外，2017 年中国农业大学刘国世课题组利用 CRISPR/Cas9 系统成功在山羊乳腺中过表达参与褪黑素合成的 5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(arylalkylamine Nacetyltransferase, AANAT)基因和乙酰血清素甲基转移酶(acetylserotonin methyltransferase, ASMT)基因，获得高褪黑素含量的功能乳，为研究生产功能乳提供了研究基础(Ma et al., 2017) 。
04
应用于家畜疾病动物模型的建立
随着新型基因编辑技术的不断发展与完善，其已广泛的应用于家畜疾病动物模型的建立。PPAR-γ (Peroxisome proliferator-activated receptor-γ)基因在人类心血管疾病的发病方面具有重要作用。Yang 等(2011)利用 ZFN 技术结合体细胞核移植技术生产出了两头 PPAR-γ 基因敲除猪，该模型的建立为人类进行心血管疾病基础研究和治疗奠定了基础。低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LD- LR)是导致家族性高胆固醇血症的重要致病基因，人类血清低密度脂蛋白升高可导致血液中胆固醇水平升高，会增加动脉粥样硬化与早发冠心病的风险。Carlson 等(2012)通过 TALEN 技术结合体细胞核移植技术生产出了特异性的LDLR基因敲除小型猪，建立了家族性高胆固醇血症理想的实验动物模型。Hai 等(2014)利用 CRISPR/Cas9 系统和显微注射技术成功地对猪的血管性血友病因子基因(von Wille- brand factor, vWF)进行了靶向沉默，vWF 基因突变可使猪体组织出血严重，出现与血管性血友病相似的动物模型，为该病的发病遗传基础研究以及治疗研究提供了很好的实验动物模型。
赖良学课题组报道了通过 CRISPR/Cas9 系统获得成活的酪氨酸酶基因(tyrosinase, TRY)敲除猪，TRY 基因的敲除致使猪存在典型的白化病表型，该研究对人类攻克白化病具有重要的应用价值 (Zhou et al., 2015) 。2018 年，该课题组与暨南大学李晓江教授、美国 Emory 大学李世华教授合作，同样应用 CRISPR/Cas9 技术将人源的突变亨廷顿基因(Huntington, HTT)基因定点插入到猪 HTT 基因座内，经体细胞核移植技术生产出了表达人源性突变型 HTT 的基因编辑猪，建立了神经退行性疾病亨廷顿病猪疾病模型(Yan et al., 2018) 。该模型的建立突出体现了使用大型哺乳动物研究神经退行性疾病及其治疗方法的重要性。帕金森综合症也是老年人中最常见的神经退行性疾病，体内DJ-1，parkin 和 PINK1 基因中隐性遗传的功能丧失突变可能是导致帕金森综合症的重要病因(Kitada et al., 1998; Lesage, Brice, 2009; Valente et al., 2004) 。Wang 等 (2016)利用 CRISPR/Cas9 技术构建出了同时针对巴马小型猪中的三种不同的基因座 parkin/DJ-1/PINK1 的人帕金森综合症猪模型。