来自测量GST 一、测量酶活性的实验注意事项 _做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

一、测量酶活性的实验注意事项（来自测量GST）1、冰水浴研磨与液氮研磨的优缺点
（1）冰水浴研磨：
冰水浴研磨容易出现因温度控制不好而导致的酶失活的现象
冰水浴研磨因为研磨时间长，细胞破碎更加充分，因此研磨效率高
（2）液氮研磨：
当植物样本很难进行冰水浴研磨时可以采用这种方法
液氮研磨由于研磨时间短，因此容易出现细胞破碎不够充分的情况。（因此在进行研磨时可以在研磨成粉末时，再用研磨杵大范围研磨。在吸胀的胚变成接近白色粉末时为止）
在研磨之后注意与提取液混合时使用漩涡振荡器进行振荡。为了防止在振荡过程中温度升高导致酶的失活和蛋白质的分解，可以几组进行切换轮着进行漩涡振荡。（共振荡400s的效果就是可以的）
尽量用差值法记录最终称取的样本的重量
2、使用蛋白质计量酶活性的意义
由于每次研磨样品，无法保证蛋白质的提取效率相同。因此需要用蛋白质浓度计量酶活性
3、蛋白质和酶提取时间
在进行实验时，蛋白质要同时进行提取。（比如都是上午进行提取）
4、用文献数据初步核实测量时是否出现问题
用自己的数据与文献进行比较。在相同的情况下，自己的数据应当与文献的数据差异不大。（如文献数据是个位数的酶活力，如果自己出现小于0或者上千的酶活力，就需要进行复查是否在测量时出现了问题。）
5、酶活体系可能出现的问题以及可能原因
（1）差值过小
对照两组的酶含量都过低
反应体系不适合，无法进行充分反应
（2）差值过大
反应体系太小，即使是活力较低的组别，反应体系也无法承载（因此在进行实验之前，要确定反应体系能否承载自己的反应）
6、测量酶活时的实验步骤顺序
先测量样品的蛋白质浓度，若浓度相近时，才可以进行下一步实验。
在有些对实验更加严格的实验中，要首先确定蛋白质浓度，然后把蛋白质浓度统一后，才能再进行酶活力测量。
（？）稀释蛋白的浓度和稀释酶活的浓度应该是相同的（？）
7、测量时应注意的事项
在检测酶活时应尽量使用相同的体系。
在使用如96孔板进行测量时，应设置空白对照以及测量空白板的数据进行校正。
在使用比色皿用分光光度计进行测量时，注意空白对照组应与测量组使用相同的比色皿以减小误差。
做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！做好Western需要注意各种细节。工欲善其事，必先利其器，首先还是从蛋白提取开始谈起。
1.收样前3min先配制细胞裂解液（现配现用），RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1 。6孔板收集蛋白每孔需200ul，计算用量。以收集六孔蛋白为例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制剂12ul，磷酸酶抑制剂12ul，混匀后置于冰上。（我使用的试剂RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制剂混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制剂混合物（100×）均购自***公司）
2.弃掉旧的培养基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul刚配好的裂解液，立即置于冰上，在摇床上裂解30min 。
（全程在冰上操作）
1.将动物组织（脑、肺等）取出后分装成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份备用），取出后立即存于-80℃ 。（注：取完一块组织后立即冻存于-80℃，反复冻存样品对待测蛋白有影响，最好用新鲜样品实验）
2.配制细胞裂解液（现配现用），组织:RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1 。配好后置于冰上。
3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃，使用时取出，操作应快捷，匀浆1min基本可保持温度。
4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中，冰上摇床裂解30min 。
我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度，和说明书protocol差别不大，稍有不同，如下：
1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7支EP管，每管加30ul生理盐水，第一管加30ulBSA，混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0 。
可提前配制：
戴好口罩和手套，选用1.0mm玻板，用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板，清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上，夹紧，向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液，将板子中水倒出，倒扣晾干。