采用AutoDockTools 4.2软件处理受体(α-CD、β-CD、γ-CD及β-CD衍生物(6-HP-β-CD、2,6-M-β-CD、2-SBE-β-CD、6-硫酸盐-β-CD、单-6-氨基-β-CD、6-羧甲基-β-CD、三乙酰基-β-CD、6-季铵-β-CD))与配体(GLD),添加H原子与原子电荷,并设置GLD分子内可旋转单键数量及根原子 。将设置好的受体和配体保存为pdbqt格式 。在分子对接过程中,均以受体几何中心为中心,建立尺寸为60 ?×60 ?×60 ?的反应约束盒子 。搜索参数选用拉马克遗传算法,算法对接的轮数设为100,能量评估的最大数目设为250 000,其他参数取默认值 。对接方法采用半柔性对接 。
1.3.1.2 相溶解度法
根据1.3.1.1节计算机模拟得到的结果选择恰当的β-CD衍生物用于本实验 。准确称取适量α-CD、β-CD、γ-CD及β-CD衍生物,用去离子水配制浓度分别为0、10、20、30、40、50 mmol/L的CD溶液;其中,β-CD和α-CD溶解度较小,配制其溶液浓度为0、2、4、6、8、10 mmol/L 。向上述不同浓度的CD溶液中加入过量的GLD,置于恒温振荡器中,25 ℃、200 r/min避光条件下孵育24 h 。取出样品溶液,5 000 r/min离心5 min,取上清液 。用80%乙醇溶液(V/V)适当稀释,在281 nm波长处测其吸光度,计算GLD的浓度 。以CD浓度为横坐标,GLD浓度为纵坐标,绘制相溶解度图 。
1.3.2 GLD/CD固体包合物的干法制备
采用捏合法制备固体包合物 。将GLD与筛选出最适宜的CD按物质的量比1∶1称量 。用2 倍CD质量的去离子水溶解CD,研磨均匀 。用无水乙醇溶液溶解GLD,配制成30 mg/mL的GLD乙醇溶液 。将GLD乙醇溶液全部滴加到CD溶液中,研磨45 min,60 ℃烘箱中干燥至质量恒定,得到固体包合物 。
1.3.3 GLD/CD固体包合物的湿法制备
将GLD与筛选出最适宜的CD按的物质的量比1∶1称量 。用去离子水溶解CD,配制成0.04 mol/L的CD溶液 。用少量无水乙醇溶解GLD,配制成30 mg/mL的GLD乙醇溶液 。将GLD乙醇溶液加入到CD溶液中,使体系中乙醇体积分数为30%,于25 ℃、200 r/min的条件下振荡24 h 。分别将所得溶液用冷冻干燥法、喷雾干燥法和共蒸发干燥法进行干燥,制备固体包合物 。
将GLD与CD按物质的量比1∶1.5和1.5∶1称量,重复上述操作,经冷冻干燥后,得到不同投料比的固体包合物 。
1.3.3.1 冷冻干燥法
用45 ℃的旋转蒸发器除去所得溶液中的乙醇,将溶液置于-20 ℃冰箱中预冻12 h 。置于冷冻干燥机中冻干后,过80 目筛 。
1.3.3.2 喷雾干燥法
用45 ℃的旋转蒸发器除去所得溶液中的乙醇 。将溶液置于喷雾干燥器中干燥,采用1 mm的加压雾化器,进样速度2.3 mL/min,进风温度180 ℃,排风温度110 ℃,雾化气流速度3.9 m3/min 。
1.3.3.3 共蒸发干燥法
将所得溶液置于60 ℃的旋转蒸发器中旋转蒸发至干 。
1.3.4 GLD/CD固体包合物饱和溶解度的测定
分别在1 mL去离子水中加入过量的经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物,在室温条件下超声溶解至平衡状态 。0.45 μm滤膜过滤,用80%乙醇溶液逐步稀释滤液到合适浓度(稀释10 000 倍) 。在281 nm波长处测定吸光度,计算GLD的含量,即为饱和溶解度 。
1.3.5 GLD/CD固体包合物包合率和载药量的测定
分别称取两份10 mg经不同制备方法得到和不同投料比的GLD/CD固体包合物 。一份溶于1 mL去离子水中,加入9 mL乙腈25 ℃超声处理20 min 。5 000 r/min离心5 min后,收集上清液,用乙腈稀释10 倍 。测定其在281 nm波长处的吸光度,根据标准曲线计算GLD的质量,即为包合物样品中GLD总质量 。
另一份加入400 μL石油醚,充分混匀 。5 000 r/min离心5 min,去上清液(用来洗去未被包合的GLD),重复洗2 次,置于烘箱中使石油醚挥发 。按上述包合物样品中GLD总质量的测定步骤测定此样品中的GLD质量,即被包合的GLD质量 。
1.3.6 GLD/CD固体包合物及相关样品的结构表征
1.3.6.1 SEM分析
对GLD、CD、GLD/CD物理混合物(以质量比1∶100混合均匀)及经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物进行扫描电子显微镜测试 。用导电双面胶将样品固定在样品台上,喷镀铂金后在3 kW条件下,分别于300、400、1 200 倍观察样品的表面形态 。
1.3.6.2 DSC分析
分别称取GLD、CD、GLD/CD物理混合物及经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物各5 mg,温度扫描范围25~300 ℃,升温速率10 ℃/min,氮气流量10 mL/min,以空盘作为参比,记录各样品的DSC图线 。
1.3.6.3 FTIR分析
分别称取适量的GLD、CD、经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物和GLD/CD物理混合物,分别与溴化钾粉末混合,放入研钵内充分研磨,再采用压片法制得样品薄片 。将样品薄片放入仪器内进行光谱扫描,扫描范围4 000~400 cm-1,分辨率4 cm-1,扫描次数32 次 。以纯溴化钾粉末作背景进行单通道扫描 。
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