国自然热点：非编码RNA编码多肽了解一下？( 二 ) ：国自然热点：非编码RNA编码

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要研究lncRNALINC00266-1有没有直接致癌作用，作者通过shRNA直接把其敲低，通过肿瘤细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭检测发现：敲除LINC00266-1后，细胞生长、集落形成、迁移和侵袭显著减少，而添加ORF（开放阅读框，是可以编码的区域）表达后这些改变恢复到对照水平，但Mut组没有恢复。这表明：RBRP肽，而非lncRNALINC00266-1本身（要编码出RBRP才行），才可以促进肿瘤发生。（图3.a-d）
细胞水平做完，作者又在动物水平中做了一遍，结果同样是恢复组有癌细胞增加，而Mut组没有改变（图3.e-g）。总的来讲，图3就是发现由lncRNALINC00266-1产生的RBRP肽发挥了致癌作用，而不是LINC00266-1lncRNA本身， RBRP在体外和体内均促进了肿瘤的发生和转移。
这一记研究非编码RNA编码多肽的招数，你学废了吗？

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4.既然排除了lncRNALINC00266-1 ，抓到了RBRP ，那就看看和它互作的蛋白有没有什么可以深挖的点吧。

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Co-IP拉下来走一遍质谱，和RBRP互作的蛋白就都出来了。作者发现有一个蛋白IGF2BP1排在了前5 。双向Co-IP证明它俩的相互结合关系。首先用RNaseA酶排除RNA中间体的关系，再用截断式Co-IP发现RBRP结合于IGF2BP1KH3-4双结构域（图4.a-f）。
Tips：此前有研究报道， KH3-4双结构域中的GxxG基序对于m6A的识别和结合是必不可少的。
所以作者在KH3-4双结构域中将GxxG突变为GEEG就完全消除了RBRP与IGF2BP1的相互作用。 G19而非G19突变成A破坏了RBRP与IGF2BP1的结合，表明RBRP中的G19残基对于IGF2BP1结合是必不可少的（图4g-j）。总之，作者在图4中发现并论证了：
RBRP可以结合到RNAm6A解读器IGF2BP1上，此发现将RBRP与m6A甲基化挂上了钩！

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5.那又到底是RBRP还是lncRNALINC00266-1增加了IGF2BP1对m6A的修饰呢？

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之前有研究表明IGF2BP1通过与编码区不稳定决定因子(CRD)结合稳定c-MycmRNA ，所以作者以c-MycCRD为检测标准，通过RNApulldown、RIP-QPCR、dotblot实验对比lncRNALINC00266-1NC/ORF/MT组，验证是：RBRP增加了IGF2BP1与m6A修饰的c-MycmRNACRD的结合（图5a-c）。
根据图4i-j图的结论（RBRP中的G19残基对于IGF2BP1结合是必不可少的）进行进一步研究，作者发现G19A突变体没有增加内源性IGF2BP1与m6A甲基化的c-MycCRD的结合，这些结果表明：RBRP通过其G19残基增加IGF2BP1与m6a修饰的c-MycCRDmRNA的结合（图5d-g）。
同时RIP-qPCR实验表明，当沉默m6A写入蛋白METTL14的表达，细胞内RNAm6A水平降低时， RBRP过表达诱导的内源性IGF2BP1与c-MycCRDRNA结合的增强显著受损，说明RBRP不会增加IGF2BP1对m6A修饰的c-MycCRD突变体的识别（图5h-i）。所以，图5结论：是RBRP ，而不是lncRNALINC00266-1本身，增强了m6A的识别和m6A阅读器IGF2BP1在RNA上的结合，如c-MycmRNA 。
6.排除干扰后，那就可以仔细盘算盘算RBRP是通过什么方式来增加c-MycmRNA的稳定性和表达的了。

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作者通过比较c-MycmRNA的稳定性，再次排除lncRNALINC00266-1的干扰，证明是RBRP增加了c-MycmRNA的稳定性，以及c-MycmRNA和蛋白水平（图6a-c）。
IGF2BP1的干扰阻断了RBRP过表达引起的c-MycmRNA稳定性增强（图d）。
随后从编码器METTL14入手，敲低后发现RBRP过表达对c-MycmRNA稳定性的增强作用被消除，而c-MycCRD突变显著取消了RBRP过表达引起的c-MycmRNA稳定性增强和c-MycmRNA和蛋白水平升高。这些结果都表明：RBRP以c-MycCRDmRNAm6a依赖的方式增加了c-MycmRNA的稳定性（图6e-h）。
随后又通过对临床样本的检测，发现c-Myc水平与RBRP致癌肽水平呈正相关（图6i-j）。总之，图6说明：RBRP通过加强IGF2BP1对c-MycCRDmRNA的m6A识别和招募RNA稳定剂到m6A甲基化的-c-MycCRDmRNA ，从而提高了c-MycmRNA的稳定性。
7.进一步研究RBRP是否以IGF2BP1结合依赖的方式促进肿瘤的发生和c-MycmRNA的稳定性

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