克隆一条给人治病的“狗” 丨春节特辑基因敲除犬

2005年，世界首例体细胞克隆狗在韩国诞生。近年来，随着 CRISPR/Cas9 技术兴起，基因编辑效率的大幅度提高，狗的基因编辑与基因编辑克隆也相继获得成功。

世界首例基因敲除犬

2014年6月底，中国科学院广州生物医药与健康研究院的赖良学研究员团队联合南京大学、广州医药研究总院有限公司等单位，利用 CRISPR/Cas9 技术率先在犬基因组中实现基因敲除，成功构建出世界首例基因（Myostatin，MSTN）敲除狗“大力神”与“天狗”，也就是敲除了狗的肌肉生长抑制素基因，让其比普通犬更加肌肉发达。四个月时，“大力神”与“天狗”就表现出超强的运动能力，且“天狗”还具有明显“双肌”性状。

MSTN 基因敲除犬“大力神”与“天狗”

2016年，赖良学团队与北京希诺谷生物科技有限公司合作，继续犬的基因编辑研究。此次研究的是一个与心血管疾病相关的基因 APOE（apolipoprotein E），用于构建心血管疾病动物模型。

2016年12月29日，世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生。20天后，另一只 APOE 基因敲除犬“葫芦”诞生。两只 APOE 基因敲除犬都表现出血脂、胆固醇升高的症状。这是我国首次将其应用于人类遗传疾病犬模型的培育，标志着我国基因编辑犬技术已走向成熟。

世界首例基因敲除克隆犬

世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生后，科研人员就展开了对“苹果”体细胞克隆的研究。2017年，赖良学研究员团队克隆出“苹果”的“翻版”——“龙龙”。这是中国首例完全自主培育的体细胞克隆犬，更是世界首例基因编辑克隆犬。

这标志着我国成为继韩国之后，第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家，填补了我国体细胞克隆犬的技术空白，并达到国际领先水平。

基因敲除克隆犬“龙龙”、“希希”、“诺诺”

基因编辑和克隆技术的结合

基因敲除犬，基因敲除克隆犬，傻傻分不清。先认识一下基因编辑与克隆技术。

基因编辑技术是一把神奇的“剪刀”，它是指对目标基因进行“编辑”，实现对特定 DNA 片段的敲除、敲入等。CRISPR/Cas9 技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

而克隆技术，是指生物体通过体细胞进行无性繁殖的技术。克隆羊“多莉”是第一例运用这种技术培育出来的动物，随后，克隆猪、牛等纷纷问世，克隆犬直至2005年才问世。基因编辑与克隆技术相结合，具有广泛的运用前景，在品种改良、疾病研究、生物医药等方面都具有巨大的价值。

上文说到的基因敲除犬，就是指在受精卵时期注射基因编辑“剪刀” CRISPR/Cas9 ，从而获得特定基因修饰的犬；而基因敲除克隆犬，采用的是“基因编辑+克隆”技术，是指首先获得基因修饰的细胞，然后再用特定基因修饰的细胞进行克隆，这样可以获得基因修饰完全一致的克隆犬。

其实通俗来说，基因敲除犬是说人们对狗狗敲入或敲除某个基因，对它“功能定制”；然后以其为模本进行复制或“批量”生产，即克隆，这个就是基因敲除克隆犬。

犬基因编辑与克隆为何如此困难

犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一，而克隆犬的首要难题是成熟卵母细胞的获取。

犬体内获取的成熟卵母细胞

用于犬体细胞克隆的成熟卵母细胞，需要采用体内成熟方法，获取体内成熟卵子。狗的发情周期长，但排卵后从卵母细胞成熟到老化的间隔时间却很短。因此，获取成熟且质量好的卵母细胞窗口期非常非常的短。这就要求科研人员准确判断狗的排卵及卵子成熟的时间，才能获得处于理想状态的卵子用于克隆胚胎的制备。

一旦错过卵子成熟的时间，下次排卵，就要等半年甚至一年。一只狗每个发情周期平均排卵7-8枚，手术取卵时间过早，卵子没有成熟；取卵子时间过晚，卵子又老化；甚至同一只狗也会出现冲出的卵子有的成熟，有的未成熟。因此，犬基因编辑与体细胞克隆尤其困难。

尽管困难重重，但赖良学研究员团队近年来还是取得了斐然的成果，而科研人员还在努力钻研，争取提高狗的基因编辑克隆效率，构建出更多具有相同遗传背景的克隆狗，用于基础科学、疾病研究、生物医药等方面的研究。

来源：中国科学院广州生物医药与健康研究院