【代谢|呼气检测：从辨味识病到代谢组分析的标准化之路( 二 )|标准化|诊断|】_

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代谢|呼气检测：从辨味识病到代谢组分析的标准化之路
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表三肿瘤患者呼出气VOCs的临床一期研究（不完全统计）[4]
多项研究表明，检测呼吸中的VOCs指纹图谱或化学基团可将患有微生物感染的个体与健康对照区分开[5] 。由于细菌独有的新陈代谢产物是人类自身无法产生的，其中细菌特异性VOCs可以作为标志物进行诊断。比如脓毒症常见的六种菌（金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）均产生异戊醇、甲醛、甲硫醇和三甲胺。而这六种菌株又各自产生特异性的金黄色葡萄球菌的异戊酸和2-甲基丁醛；用于铜绿假单胞菌的1-十一碳烯、2-丁酮以及大肠杆菌的甲醇、戊醇、乙酸乙酯和吲哚等[6] 。
对于病原感染来说现有很多检测方法，但是各有各的优缺点。常用的急性感染蛋白标志物有CRP、PCT和SAA等，这类检测的优点是快速便宜，但是无法精准辨别感染的菌种类别。而新晋的核酸检测包括PCR、mNGS等优点是可以对感染菌种准确分型，且可以分析耐药信息以获得更好的用药指导及预后。但是检测周期较长，对不同感染类别的取样及样本类型要求复杂多变以及价格较高是限制临床全覆盖的重要因素。因此一个检测方便快捷、价格便宜且可以对菌种分型鉴定的呼气检测有其独特的临床优势。
代谢|呼气检测：从辨味识病到代谢组分析的标准化之路
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表四部分感染性疾病及其潜在VOCs ，来源：奇迹之光-文章整理
样本采集的标准化可以提高检测结果的重现性
宿主和共生微生物的内源性VOCs相互作用大大增加了呼气代谢组的复杂性，而且呼气中VOCs含量通常非常稀少，低至百万分之几（ppmv）甚至十亿分之几（ppbv），因此要实现可靠、高质量、标准化的呼吸采样及分析检测存在相当的挑战。
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图三呼气采集流程[7]
样品预浓缩方法与高灵敏度的分析仪器至关重要，样本采集核心是采集到不包含环境气体成分的内源性气体，以供精确分析和避免干扰因素。
一次连续的呼气根据CO2分压分为四个时项相，分别是死腔通气、死腔通气及肺泡内气体体混合过渡期、肺泡气和呼气末期。相比于阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的混合采样来说，阶段Ⅲ的采样更具有代表性，且避免了引入外源性气体带来的检测结果假阳性。采样的原则是在获取呼吸样本时需要严格控制流程并保证采样可重现。
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图四时间-二氧化碳分压波形图[7]
样本预浓缩有助于提高检测性能，但带来样本损耗及重现性差
由于传统的分析方法限制，需要对样本进行预浓缩以提高分析精度，同时也一定程度降低分离纯化过程中会带来的巨大损耗。常见的气体样本浓缩方法有热脱附（TD）管和固相微萃取（SPME）。
热脱附管用吸附剂把气体吸附富集，再通过加热的方式解吸附释放到检测仪器中。常用的吸附剂包括Tenax TA & GR、Carbograph 5TD、碳分子筛（Carboxen）等。为了防止分析物的过度吸附损失导致失去一些痕量的潜在VOCs标志物，对挑选吸附材料也极为讲究。但无论是在挥发性还是在极性方面，填充界面的分析物与吸附剂之间的相互作用会一定程度的影响重现性，从而影响化合物的回收率，甚至可能影响储存期间的稳定性。
固相微萃取是一种非常简单有效的无溶剂样品制备方法，可以把常规液-液萃取的所有步骤包括萃取、浓缩和转移检测都集成到一个设备中，从而大大简化了样品制备过程。它将涂覆的熔融石英纤维暴露于样品的顶部空间，然后使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚丙烯酸酯（PA）涂层材料作为吸附，样品中的分析物被直接富集到纤维涂层中，最终与气相色谱法联用进行VOCs的检测[8] 。