正德三年（1508年）进士，嘉靖初年，升为大理寺丞，误判李福达重罪被革职 。嘉靖十五年（1536年），因明世宗欲图征讨安南，毛伯温被任命为兵部尚书 。
嘉靖十九年（1540年），毛伯温不费一刀一剑讨平安南归朝，封太子太保 。嘉靖二十一年（1542年），毛伯温上书巩固边防，明世宗同意 。嘉靖二十三年（1544年）秋，毛伯温被人诬陷发放边疆，途中被赦免还乡，还乡后不久病发去世 。
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