对于竞争法也需要注意一点,酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好,然后同时加入固相载体,不然会造成不公平竞争,检测出现偏差;抗体的检测设计就方法来说,有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计 。1、 间接法,这个是检测抗体最常用也最简单的方法 。操作步骤与双抗夹心一样,只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了,加入样品后洗涤,再加入的酶标记抗抗体,然后显色,颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关 。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的,为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了,以此类推,之前的双抗夹心法也可以叫做直接法,命名其实就是这么回事,规则多了就容易让人糊涂 。间接法也有一些自己的特点,1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型,可用于鉴别感染时期,如果是IgM那么提示感染早期;2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高,容易产生假阳性,如果封闭不完全,可出现全板阳性,挺吓人的 。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等 。
2、 双抗原夹心法,这个完全是山寨双抗夹心法的 。原理和步骤也与双抗夹心一样一样的,与间接法相比,具有优越的灵敏度和特异性,但不是很常用,因为就目前的技术条件,想得到能用于ELISA检测的纯化抗原还是有一定的难度 。临床上常用于检测HIV抗体初筛,TP抗体和抗HBs抗体等,这些检测对特异性和灵敏度,准确性都要求特别高 。
3、 竞争法,和检测抗原设计的竞争法完全一致,临床上用的不多,我仔细总结了一下两个很具有代表性的,也各具特点 。1、抗HBc抗体,检测方法与抗原相同,包被抗原之后,分两组,一组加入预先混匀的酶标抗体和待测样品,一组只加入酶标抗体,两组的显色之差可代表待测抗体的相对含量,需注意的是待测抗体与酶标抗体是同一物质;2、抗HBe抗体检测,方法与抗原竞争法设计稍有区别,包被的抗HBe抗体后,检测也分两组,一组先加入酶标HBeAg再立即加入待测样品,一组只加酶标HBeAg,两组显色之差代表待测抗体的相对含量,这种设计中包被抗体和待测抗体是同一物质 。值得注意的是混合组不是事先混匀再加入,而是先加入待测抗体后再加入酶标抗原 。所有的这些复杂的注意事项确实很容易把人搞晕,但是童鞋们只需要记住一条,竞争很残酷,我们就要想尽一切办法保证竞争的公平性,这样就不会错 。
4、 捕获法,这种方法比较少用,由于具有识别抗体类型的优点,仅用于需要早期诊断的急性感染或者具有爆发性感染的疾病,如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等 。原理还是逃不脱经典的双抗夹心,具体方法是先包被能识别抗体类别的抗抗体,洗涤后加样品,再洗涤,加酶标记抗原,洗涤后显色,这些步骤闭上眼睛都能写出来 。
最后说两句,与抗原检测不同,抗体检测的设计不是根据抗体的结构特点了,这么多种设计方法,童鞋们用的时候就会选择障碍了,掌握2个原则,1.实验要求,如果需要特异性和准确性特别高,那肯定是双抗原夹心法,要求马马虎虎,那就间接法,如果要明确抗体类型,最好的选择就是捕获法了;2.实验成本,与纯化抗体不一样,有时候想要获得纯化的抗原是非常困难的,更别说两种不同的纯化抗原了,所以双抗原夹心法临床上用的并不多 。ABS-ELISA顺便说一下ABS-ELISA设计,其实是和上面说的一样的,通过亲和素-生物素系统(ABS)方法显色反应,增加检测灵敏度而已,但是增加操作步骤与实验成本,而且现在单克隆抗体的技术越见成熟,抗体特异性和亲和力大大提高,灵敏度已经不是问题,所以这些次等装备已经不常用 。
结果判定最后和童鞋说说ELISA结果判定,分定性和定量两种 。对于定性试验,参比阴、阳性对照的吸光度,以P/N或者S/CO比值形式报告 。1.P/N比值是指(待测样本-空白对照)/(阴性样本-空白对照),一般以P/N≥2.1判为阳性,或许求知欲旺盛的童鞋会问,那么竞争法用P/N比值怎么判,呵呵,这里先不说,卖个乖,你可以百度或者私信我啊;2. S/CO比值,S是待测样本吸光度值,CO为CUT-OFF值,通常取值阴性对照平均值的2.1倍 。S/CO比值≥1为阳性,竞争法S/CO比值≤1为阳性 。定量检测没有什么可说的,老老实实做标准曲线,既锻炼实验操作能力,又可作为实验内部参照 。
记得有这么个规定,定性检测不能目测判断,要凭借酶标仪检测,定量要在每次实验都得与待测样本相同实验条件下绘制标准曲线,有一难度,但是为了对实验负责,你就从了吧 。
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